Системна микробиология

Тази статия е част от изследователската тема

Взаимодействия между диетите, чревната микробиота и метаболизма на домакините Вижте всички 55 статии

Редактиран от
Юхен Луо

Земеделски университет в Съчуан, Китай

Прегледан от
MAURIZIO SANGUINETTI

Католически университет на Свещеното сърце, Италия

Моника Ди Паола

Университет във Флоренция, Италия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

frontiers

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по биомедицински науки, Университет в Сасари, Сасари, Италия
  • 2 Porto Conte Ricerche, Научно-технологичен парк на Сардиния, Алгеро, Италия
  • 3 Катедра по биомедицински науки, Университет в Каляри, Каляри, Италия

Въведение

Сред хлебните изделия хлябът е най-често консумираната храна в световен мащаб, като се увеличава търсенето на продукти, съдържащи пълнозърнести храни, богати на фибри или получени чрез преработка, която насърчава здравето, като заквасването на закваска. Доказано е, че използването на закваска подобрява вкуса, структурата и срока на годност на печения хляб, поради разликите в химичните и физическите му характеристики в сравнение с кваса от хлебна мая (Gobbetti et al., 2016).

Освен това ферментациите на зърнените култури са широко признати като голям потенциал за подобряване на хранителното качество на хранителните съставки и техните здравословни ефекти. Редица проучвания твърдят, че специфична зърнена матрица и/или хлебни процеси, използвани за производство на хляб, могат да доведат до подобряване на клиничните параметри при обичайните потребители (Korem et al., 2017). Заквасването на закваска активно забавя смилаемостта на нишестето, което води до ниски гликемични реакции и може да увеличи производството на несмилаеми полизахариди, които излизат от тънките черва, заедно със зърнени влакна, като в крайна сметка подхранват микробиотата на дебелото черво (Maioli et al., 2008; Scazzina et al ., 2009; Sanna et al., 2018). За тази цел избрани видове млечнокисели бактерии (LAB) са тествани с цел подобряване на качеството на хляба (De Vuyst et al., 2014). Също така втасването на закваска модулира нивата и биодостъпността на биоактивни съединения и подобрява бионаличността на минералите (Di Nunzio et al., 2018).

Различните ензимни дейности във ферментацията на закваска и хлебна мая могат да бъдат отговорни за специфичната хидролиза на протеини и полизахариди. Протеиновата хидролиза от своя страна може да повлияе на абсорбцията на биоактивни съединения, както и на други метаболити, влияещи върху физиологията на гостоприемника. Също така се предлага закваска за получаване на хляб със силно разграден глутен, който може да е подходящ за индивиди с непоносимост към глутен (т.е. с нечувствителност към целиакия към глутен) (Gobbetti et al., 2018a, b).

Поразително е, че ферментацията на закваски също е демонстрирана за намаляване на съдържанието на акриламид в пшеничния хляб (Bartkiene et al., 2013). Що се отнася до другите хранителни продукти, фактори, влияещи върху образуването на акриламид по време на производството на хляб, са акриламидни прекурсори (главно аспарагин), редуциращи захари и специфични условия на обработка. Тези характеристики на закваската имат важни практически последици, тъй като са демонстрирани невротоксичност на акриламид, генотоксичност, канцерогенност и репродуктивна токсичност (Keramat et al., 2011), а хлебните изделия представляват около 20% от излагането на човека на акриламид.

Въз основа на тези предпоставки, това проучване е предназначено да придобие представа за сложното взаимодействие между ефектите на закваската върху приготвянето на хляб и таксономията на чревната микробиота (ГМ) и функционалните дейности и, от своя страна, да изясни възможното му въздействие върху метаболизма и здравето на потребителя. Към днешна дата не е оценен специфичният принос на консумацията на хляб със закваска за функционалните дейности на микробиотата. Следователно, ние сравнихме състава и активните функции на микробните чревни съобщества в три групи плъхове, хранени с диета, допълнена със заквасен хляб (SB), квасен хляб с хлебна мая (BB) или диета без добавки. По-конкретно, ние избираме да оценим въздействието на консумацията на закваска при плъхове, хранени с диета с ограничено съдържание на калории, въз основа на състава с високо съдържание на фибри с ниско съдържание на мазнини, за да избегнем модификации на ГМ, които вече са свързани с диетите с високо съдържание на мазнини и/или с висока захар. С този подход ние също така минимизирахме потенциалните объркващи ефекти поради индивидуалната разлика в приема на храна, обикновено срещаща се при хранени животни ad libitum (AL).

Материали и методи

Животни и проби

Общо 16 плъха Fischer 344 (на 10 седмици, мъжки) са закупени от Charles River Laboratories Italia, SRL (Calco, Италия) заедно с производителя на животинска чау VRF1 (P) 811900 (4,5% от мазнините). Животните бяха разпределени по две на клетка и се поддържаха на дневни цикли с редуващи се 12 часа светлина-тъмнина (светлина в 23:00, светлина изключена в 11 сутринта), с налична храна и вода AL. Проучванията върху животни бяха прегледани и одобрени от институционалния комитет за грижи и употреба на животните към Университета в Каляри и бяха извършени в съответствие със съответните насоки и разпоредби (разрешение на италианското министерство на здравеопазването № 840/2016-PR). След 2 седмици аклиматизация, плъховете бяха разделени на четири групи от по четири плъха и бяха изложени на следния график на хранене. Първата група продължи на диета с AL чау (група „chow-AL“), докато останалите три групи бяха хранени с диета с ограничен калории (CR), изчислена като 70% от приема на храна с AL, както беше съобщено по-рано (Fraumene et al ., 2018; Tanca et al., 2018). Сред плъхове, хранени с CR, една група е получила само лабораторна чау (група „чау“), докато останалите две групи са били допълнени (15% тегл./Тегл.) С типичен сардински хляб (карасау хляб, произведен от местна хлебопекарна), квасен съответно с BB (група „BB“) или SB (група „SB“).

Животните се претеглят седмично и се умъртвяват след 4 седмици лечение със съответните им диетични режими.

Гликемията се измерва с анализатор на глюкоза II (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Взети са кръвни проби от опашната вена 1 час преди доставката на храна или 2 часа след доставката на храна.

Проби от съдържание на изпражнения, черен дроб и дебелото черво се събират от плъхове, хранени с CR след 4 седмици диетично лечение, докато плъховете, хранени с AL, се използват просто като контрол на растежа. Фекални проби бяха събрани от всички животни, с изключение на един плъх, принадлежащ към групата „чау“. Съдържание на дебелото черво и чернодробни проби бяха събрани от всички животни след умъртвяване. Всички проби веднага се съхраняват при -80 ° C до употреба. По време на анализите пробите от изпражненията се размразяват при 4 ° C и от всяка от тях се събират по две порции, съответно за екстракция на протеини и ДНК; съдържанието на дебелото черво се обработва директно за екстракция на ДНК, докато чернодробните проби се обработват директно за екстракция на протеин.

ДНК екстракция и 16S rRNA генно секвениране

Екстракция на протеини и протеомичен анализ

Единадесет фекални проби и 12 чернодробни проби, събрани от плъхове, принадлежащи към групите „чау“, „ВВ“ и „SB“, бяха подложени на стъпки за биене на зърна и загряване/замразяване след ресуспендиране в редуциращ екстракционен буфер на базата на SDS, като описани по-рано (Tanca et al., 2014). Протеиновите екстракти бяха почистени, алкилирани и смилани от трипсин съгласно процедурата за приготвяне на проби с помощта на филтър (Wisniewski et al., 2009), с незначителни модификации, илюстрирани другаде (Tanca et al., 2013, 2015).

Анализите на течна хроматография (LC) -тандемна масова спектрометрия (MS/MS) бяха извършени на LTQ Orbitrap Velos масспектрометър (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), работещ с източник на EASY-спрей, свързан с UltiMate 3000 RSLCnano LC система (Thermo Fisher Scientific). Пробите се провеждаха в произволен ред. След зареждане, пептидни смеси (4 μg на цикъл) се зареждат, концентрират и обезсоляват върху улавяща предварителна колона (Acclaim PepMap C18, 75 μm × 2 cm nanoViper, 3 μm, 100 Å, Thermo Fisher Scientific), използвайки 0,2% мравчена киселина при скорост на потока 5 μl/min. Разделянето на пептидите се извършва с колона C18 EASY-спрей (PepMap RSLC C18, 75 μm × 50 cm, 2 μm, 100 Å, Thermo Fisher Scientific) при 35 ° C със скорост на потока 250 nL/min за 247 минути, използвайки следния двустепенен градиент на елуент В (0,2% мравчена киселина в 95% ACN) в елуент A (0,2% мравчена киселина в 5% ACN): 2,5–37,5% за 242 минути и 37,5–99% за 5 минути.

Масспектрометърът е настроен в зависим от данни режим MS/MS, където пълният спектър на сканиране (от 375 до 2000 m/z) е последван от MS/MS спектри, под пряк контрол на софтуера Xcalibur. Инструментът работи в положителен режим. Температурата на капиляра за прехвърляне на йони и напрежението на пулверизирането бяха определени съответно на 250 ° C и 1.85 kV. Пълните сканирания и MS/MS спектрите бяха получени в Orbitrap с резолюции съответно 60 000 и 7500 при 400 m/z. Автоматичният контрол на усилването е настроен на 1 000 000 йона и опцията за заключване на масата е активирана на протониран полидиметилциклосилоксанов фонов йон като вътрешно повторно калибриране за точни измервания на масата (Olsen et al., 2005). Пептидните йони са избрани като 10-те най-интензивни пика на предишното сканиране; прагът на сигнала за задействане на събитие MS/MS е зададен на 500 броя, а динамичното изключване е зададено на 30 s. Като метод на фрагментация беше използвана дисоциация с по-висока енергия при прилагане на 35% стойност за нормализирана енергия на сблъсък, широчина на изолация от m/z 3.0, Q-стойност от 0,25 и време на активиране от 0,1 ms. Като газ за сблъсък се използва азот.

Идентификацията на микробен пептид е извършена с помощта на информативната платформа Proteome Discoverer (версия 2.0; Thermo Fisher Scientific), с Sequest-HT като търсачка и Percolator за валидиране на пептиди (FDR 0,1% в поне една проба (общо 17 389 188 последователности). Всички бази данни за микробни последователности са депозирани в PRIDE заедно с данни от MS. Вторият възел за обработка е изграден върху база данни, съдържаща протеиновите последователности, принадлежащи към реда Rodentia и депозиран в UniProtKB/SwissProt (издание 2017_11; общо 26 656 последователности). подложен само на втория обработващ възел.

Таксономична и функционална анотация е извършена с помощта на множество стратегии. MEGAN v.6.8.19 беше използван като първа опция за анотиране (Huson et al., 2016). Протеиновите последователности бяха предварително подложени на търсене DIAMOND (v.0.8.22) срещу базата данни NCBI-nr (актуализация 2017/09), като се използва командата blastp с параметри по подразбиране (Buchfink et al., 2015); след това DIAMOND изходите бяха заредени на MEGAN и класификацията с най-нисък общ предшественик (LCA) беше извършена с използване на параметри по подразбиране. Освен това уеб приложението Unipept (v.3.3.4; https://unipept.ugent.be) е използвано за извършване на LCA класификация на идентифицираните пептидни последователности (Mesuere et al., 2017). Функционално анотиране беше постигнато чрез подравняване на идентифицираните протеинови последователности спрямо база данни, съдържаща всички бактериални последователности от UniProtKB/Swiss-Prot (издание 2017_09), използвайки DIAMOND (blastp модул, праг на e-стойност 10 −5); Впоследствие присъединителните номера на UniProtKB/Swiss-Prot бяха използвани за извличане на информация за семейството на протеини от уебсайта на UniProt чрез инструмента за извличане (Pundir et al., 2016). Данните за метапротеомичен спектрален брой, получени за всяка проба, бяха обобщени въз основа на функционалните и таксономични нива на анотиране, генериращи таблици на изобилие от семейства специфични и специфични за рода протеинови семейства.

Статистически анализ и генериране на графики

Проведен е диференциален анализ на данни за четене (16S rRNA генно секвениране) и спектрални (метапротеомика) данни за броене, използвайки пакета edgeR, наличен в Galaxy сървър (https://bioinf-galaxian.erasmusmc.nl/galaxy) (Robinson et al., 2010 ). The стр-списъците със стойности, предоставени от edgeR, впоследствие бяха подложени на многократно тестване на базата на последователен метатест за добро съответствие (SGoF) (Carvajal-Rodriguez et al., 2009) с помощта на софтуера SGoF + (v.3.8) с параметри по подразбиране (Carvajal-Rodriguez и de Una-Alvarez, 2011). Коригиран стр-стойност * = коригирана стр-стойност ** = коригирана стр-стойност *** = коригирана стр-стойност Ключови думи: чревна микробиота, метагеномика, метапротеомика, хранителни процеси, закваска, диета

Цитиране: Abbondio M, Palomba A, Tanca A, Fraumene C, Pagnozzi D, Serra M, Marongiu F, Laconi E и Uzzau S (2019) Фекален метапротеомичен анализ разкрива уникални промени във функциите на чревния микробиом след консумация на закваска Карасау Хляб. Отпред. Микробиол. 10: 1733. doi: 10.3389/fmicb.2019.01733

Получено: 12 април 2019 г .; Приет: 15 юли 2019 г .;
Публикувано: 30 юли 2019 г.

Yuheng Luo, Сечуански селскостопански университет, Китай

Маурицио Сангвинети, Католически университет на Свещеното сърце, Италия
Моника Ди Паола, Университет във Флоренция, Италия

† Тези автори са допринесли еднакво за тази работа

‡ Настоящ адрес: Алесандро Танка, Департамент по биомедицински науки, Университет в Сасари, Сасари, Италия