• Тази статия е актуализирана
  • Поправката към тази статия е публикувана в Nutrition & Metabolism 2020 17: 30

Резюме

Заден план

Подходящият състав на мастните киселини на мозъчните липиди е от решаващо значение за функционирането на този орган. Промените в състава на мастните киселини в мозъка могат да доведат до неврологични и невродегенеративни заболявания.

Методи

Целта на тази работа е да се оцени ефектът от западната диета, съдържаща високо съдържание на мазнини, върху състава на мастните киселини на мозъчните липиди. В това проучване използвахме мишки, хранени с високомаслена диета (HFD) в продължение на 19 седмици. Мозъчните липиди се разделят чрез SPE екстракция и съставът на мастните киселини в чау, мишки серум, мозък и други тъкани се анализира по GC-MS метод.

Резултати

Теглото на тялото и теглото на мастната тъкан на мишки след HFD се увеличи значително. Концентрациите на повечето мастни киселини в серума на мишките след HFD се повишават поради по-високата им доставка от храната. Неочаквано концентрацията на серумна ейкозапентаенова киселина (EPA) е по-ниска при мишки след HFD, отколкото при контролите. Също така съдържанието на EPA в мозъка и други тъкани е по-ниско. Сред изследваните групи мозъчни липиди EPA е значително намален при фосфолипидите и сфинголипидите.

Заключения

Имайки предвид важната роля на мозъчното СИП, включително поддържане на подходящ състав на липидите на клетъчните мембрани и противовъзпалителни свойства, заключаваме, че намаляването на мозъчното СИП след западна диета може да доведе до нарушена мозъчна функция.

Заден план

Западната диета се характеризира с намален прием на n-3 полиненаситени мастни киселини (PUFA), високо наситени FAs и прием на n-6 PUFA, както и повишени нива на рафинирана захар и прекомерна употреба на сол [1]. Гореспоменатите фактори допринасят за епидемията от затлъстяване, един от основните проблеми на общественото здраве в света [2]. Повече от двама на всеки трима възрастни в САЩ са със затлъстяване или с наднормено тегло [3, 4]. Също така, повишените нива на рак, повишено възпаление, намален контрол на инфекцията и повишен риск от алергични и авто-възпалителни заболявания са един от многото негативни ефекти на западната диета. Очарователно е, че някои от нашите лоши диетични поведения имат генетичен произход и се предават на нашето потомство [5].

Материали и методи

Целта на нашата работа беше определянето на нивата на полиненаситени мастни киселини в мозъка и в други органи на мишки, хранени с високомаслена диета (HFD), което е еквивалент на човешка западна диета. 2.1 Животни и лечение.

Двадесет и шест седмични мъжки мишки C57BL/6 от Центъра за изследвания и обслужване на лаборатории за животни Tri-City, Медицински университет в Гданск, бяха разпределени на случаен принцип за две експериментални групи (средно телесно тегло 21,8 g). Всяка мишка имаше индивидуална маркировка. Първата група е хранена с нормална диета, съдържаща 10% мазнини (Altromin, ME 14,6 MJ/kg), докато мишките от втората група са хранени с високо съдържание на мазнини, съдържаща 60% мазнини (Altromin, ME 21,1 MJ/kg). Животните бяха настанени в продължение на 18 седмици в полисулфонови клетки при температура 22 ± 2 ° C, влажност 55 ± 10%, 12-часов цикъл на тъмна светлина, с въздух, обменен 12 или повече пъти на час. Мишките бяха хранени по желание и имаха свободен достъп до вода. Телесното тегло и приема на фураж се измерват ежеседмично. В края на експеримента се убиват мишки и се събират кръв, както и проби от мозък, черен дроб, бъбреци, мускули и подкожна, епидидимална и ретроперитонеална мастна тъкан. Кръвта се центрофугира при 3000 × g в продължение на 15 минути при 4 ° С и серумът се съхранява при - 80 ° С. Пробите от тъкани незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при - 80 ° C до анализ.

Анализ на липидите

приготвяне на пробата

Екстракцията на общите липиди от тъканите и серума се извършва със смес хлороформ: метанол (2: 1, v/v), както е описано от Folch et al. [26], хлороформната фаза беше събрана и изсушена под азотен поток. След това липидните екстракти бяха разделени на две части: за SPE екстракция и анализ на профила на мастните киселини (FA) от общите липидни проби.

SPE екстракция

Пробите от тъкани се фракционират съгласно две процедури, които се различават по отношение на събраните липидни фракции. Процедура I, описана от Kaluzny et al. [27], дава свободни мастни киселини (FFA), полярни липиди/фосфолипиди (PL) и ацилглицероли (AG). Накратко, 2 mg тъканни екстракти, приготвени с Folch et al. [26] метод се разтварят в хлороформ и се зареждат в аминопропилни патрони (Strata® NH2 500 mg, Phenomenex®), предварително кондиционирани с 4 ml н-хексан. След това липидите се елуират, както следва: 6 ml хлороформ: изопропанол (2: 1, v/v) - неутрални липиди (NL), 6 ml диетилов етер: оцетна киселина (98: 2, v/v) - FFA, 6 мл метанол - PL. Тези фракции бяха запазени и изпарени до сухо. След това NL бяха възстановени през н-хексан и се зарежда върху вторичен аминопропилов патрон, както е описано по-горе. След това колоната се елуира с 6 ml н-хексан - холестерилови естери, изхвърлени, 9 ml диетилов етер: метиленхлорид:н-хексан (1:10:89, v/v/v) - триацилглицероли (TAG), 18 ml етилацетат:н-хексан (5:95, v/v) - холестерол, изхвърлен, 6 ml етилацетат:н-хексан (15:85, v/v) - диацилглицероли (DAG) и 6 mL хлороформ: метанол (2: 2, v/v) - моноацилглицероли (MAG). Фракциите на ацилглицеролите (AG) бяха смесени и изсушени под азотен поток.

Процедура II следва Bodennec et al. [28] метод. 1,5 mg тъканни екстракти, приготвени с Folch et al. методът беше разтворен в хлороформ и зареден в аминопропилни патрони (Strata® NH2 500 mg Phenomenex®), предварително кондиционирани с 5 ml н-хексан. След това пробите се елуират с 5 ml етилацетат:н-хексан (15:85, v/v) - неутрални липиди без керамиди (Cer), MAG и FFA, 4 ml хлороформ: метанол (23: 1 v/v) - Cer, 3 ml диизопропилов етер: оцетна киселина (98: 5, v/v) - FFA и α-хидрокси-FFA (α-OH-FFA), 11 ml ацетон: метанол (9: 1,35 v/v) - гликосфинголипиди (GSPL) и хлороформ: метанол (2: 1, v/v) - сфингомиелини (SM). Елуатите се изпаряват до сухо.

Стъпка на хидролиза

Получените проби от I и II SPE процедури, както и общите липидни проби, след това се хидролизират с 1 ml 0,5 M KOH в метанол при 90 ° С за 3 h. След това сместа се подкиселява с 0,2 ml 6 М НС1. След това се добавят 1 ml вода и FA се екстрахират три пъти с 1 ml н-хексан и се суши под азотен поток.

GC-MS анализ

FA след хидролиза се дериватизират, като се използва 10% разтвор на бор трифлуорид-метанол при 55 °, за да се получат FA метилови естери (FAME). След 1,5 h към сместа се добавят 1 ml вода и FAME се екстрахират три пъти с 1 ml н-хексан и се суши под азотен поток. Приготвените FAME се анализират с GC-EI-MS QP-2010SE (Shimadzu, Япония). Разделянето на FAME беше проведено на капилярна колона Zebron ZB-5MSi (30 m дължина × 0,25 mm i.d. × 0,25 μm дебелина на филма). Температурата на GC фурната беше зададена на 60–300 ° C (4 ° C/min) с общо време на работа от 60 минути. Хелий се използва като газ-носител с налягане в колоната 100 kPa. Детекцията на масова спектрометрия се извършва с източник на електронен удар, работещ при 70 eV. Придобиването на мас спектри беше проведено с пълен режим на сканиране с обхват на сканиране на маса m/z 45–700. Като вътрешен стандарт се използва 19-метиларахидна киселина. FA бяха идентифицирани с помощта на референтни стандарти (37 FAME Mix, Sigma-Aldrich) и справочна библиотека NIST 2011.

Статистически анализ

За нормално разпределени данни статистическата значимост на разликите между средните стойности е оценена чрез използване на параметрични (Student’s T), докато данните без нормално разпределение са анализирани чрез непараметрични (U Mann-Whitney, Wilcoxon) тестове. Данните са представени като средни стойности ± SD. Всички изчисления са извършени с помощта на софтуера Sigma-Plot 11 (Systat Software, Inc., 2008).

Резултати

Индукция на затлъстяване от HFD

Лечението на мишки с HFD (съдържащи 60% мазнини) в продължение на 19 седмици води до значително увеличение на телесното тегло в сравнение с контролите, хранени със стандартна диета за лабораторни мишки (SD), включваща 10% мазнини (фиг. 1). Статистически значимата разлика се наблюдава, започвайки от втория месец на лечението (Фиг. 1). След 19 седмици експеримент, наблюдаваме около 30% увеличение на средната телесна маса на HFD мишки (Таблица 1). Няма значителни промени в масата на мозъка, сърцето и черния дроб, но може да се наблюдава нестатистическа тенденция за по-висока маса на черния дроб при HFD мишки (Таблица 1). Всички складове с мастна тъкан (AT) са много по-тежки при HFD мишки, отколкото при контролите, а също и теглото на бъбреците е значително по-високо (Таблица 1).

диета

Ефект на HFD върху съдържанието на FA в серума и избраните миши органи

Концентрациите на всички n-3 PUFA (с изключение на EPA), както и n-6 PUFA са по-високи или подобни в серума на HFD мишки в сравнение с контролите (Таблица 2), което вероятно е свързано с по-високо съдържание на всеки PUFA в чау с високо съдържание на мазнини (Таблица 2). Изненадващо наблюдавахме двукратно намаляване на концентрацията на EPA в серума на HFD мишки, въпреки факта, че както контролните мишки, така и мишките с индуцирано затлъстяване консумират чау, съдържащ еднакъв дял от всички n-3 PUFA в диетата си, и количествата на всички n-3 PUFA са по-високи при чау с високо съдържание на мазнини (Таблица 2). Също така бяха открити по-ниски концентрации на EPA от DHA в серума както на SD, така и на HFD мишки (Таблица 2). Общите мастни киселини в HFD мишки са били почти два пъти по-високи, отколкото в SD групата (Фиг. 2).

Най-големите статистически значими разлики в съдържанието на EPA са отбелязани в черния дроб и те също са значителни в три депа за мастна тъкан (Таблица 2). Нивата на наситени серумни мастни киселини (SFA) са по-високи при HFD мишки, докато разликата в мононенаситените мастни киселини (MUFA) не е статистически значима (Таблица 2). Освен това съдържанието на SFA е значително по-ниско в ретроперитонеалната и подкожната мастна тъкан, докато MUFA са по-ниски в епидидималната мастна тъкан, сърцето и бъбреците. Повечето от другите n-3 и n-6 PUFA съдържания бяха увеличени или непроменени в изследваните тъкани. Само нивото на дихомо-γ-линоленова киселина (DGLA) е намалено в чернодробните мускули и всички депа на мастната тъкан, докато съдържанието на ARA е намалено само в подкожната мастна тъкан (Таблица 2). Също така забелязахме, че в мастните тъкани EPA е най-разпространеният FA сред n-3 PUFA, което не е случаят в черния дроб. Вероятно това е ефект от високи концентрации на EPA в използвана чау (таблица 2). Черният дроб е основен орган на метаболизма на FA, докато мастната тъкан извлича основно FA от циркулацията и ги съхранява под формата на TAG.

Промени в съдържанието на EPA в мозъка след диета с HFD

Най-разпространеният PUFA сред общите FA в мозъка на мишки е DHA, последван от ARA. EPA присъства в значително по-ниски количества (Таблица 2). Съдържанието на EPA е повече от 2 пъти по-ниско в мозъка на мишки, хранени с HFD и, най-важното, това е единственият PUFA, чието съдържание е по-ниско в мозъка на HFD, отколкото при SD мишки.

Липидите са много разнообразна група съединения и всеки от тях играе различни функции. Следователно, ние отделихме липидите от мозъка на мишки върху няколко липидни групи. Една от използваните химически процедури за разделяне на липидната фракция е Kaluzny et al. [27] SPE метод, който позволява да се получат три липидни фракции, ацилглицероли (AG), полярни липиди/фосфолипиди (PL) и свободни/неестерифицирани мастни киселини (NEFA). Процентният дял на определени липидни фракции при HFD мишки е променен в сравнение с SD мишки (Фиг. 3). Открихме значително по-висока AG фракция в мозъка на HFD мишките (Фиг. 3). Съдържанието на PL в мозъка на SD мишки след Kaluzny et al. [27] разделяне, възлиза на почти 70% от липидите и е малко по-нисък в мозъка на HFD мишки, но не е статистически значим (Фиг. 3).

Вторият метод за разделяне на липидите в мозъка е модификация на Bodennec et al. [28] метод. Чрез използването на този метод получихме шест фракции, включително а) неутрални липиди, б) керамиди (Cer), в) нормални и α-хидрокси свободни мастни киселини, г) неутрални гликосфинголипиди (GSPL), д) сфингомиелин (SM) и f ) сфингозин 1-фосфат, керамид 1-фосфат и сулфатиди. В нашето проучване ние се фокусирахме върху Cer, GSPL и SM, поради тяхната основна функция в мозъка [29]. Установихме значително намалена GSPL фракция, докато увеличена SM фракция в мозъка на мишки след HFD в сравнение с контролите. Съдържанието на мозък в Cer е било сходно и в двете групи (фиг. 4).

След това анализирахме състава на FA в отделени фракции липиди от мозъка на мишки (Таблица 3). Най-високото ниво на EPA сред липидните фракции в мозъка на SD мишки се наблюдава при фракция PL и само при тази фракция сред тези, получени от Kaluzny et al. [27] Метод SPE съдържанието на EPA е статистически по-ниско в мозъка на HFD мишки (Таблица 3). В ацилглицеролите няма разлика в съдържанието на EPA между мозъците на SD и HFD мишки, докато във FFA фракцията съдържанието на EPA е дори по-високо при HFD мишки. Интересното е, че въпреки че EPA и DHA принадлежат към дълги вериги n-3 PUFA, тяхното участие в конкретната липидна фракция на мозъка е много различно. Най-разпространената PUFA в PL фракцията е DHA, което ниво е значително повишено в HFD мозъка (Таблица 3). Във фракцията GSPL и Cer нивата на EPA и DHA са значително по-ниски от нивото на ARA (Таблица 3). Също така, за разлика от DHA и ARA, във всяка определена сфинголипидна (SPL) фракция наблюдаваме значително намалени нива на EPA в мозъка на HFD мишки (Таблица 3).

Дискусия

Промени в съдържанието на EPA в мозъка след диета с HFD

Промени на конкретна липидна фракция в мозъка на мишки след диета с HFD

В това проучване за първи път е изследван профилът на мастните киселини, по-специално липидните фракции в мозъка на мишки, лекувани с HFD. Една от използваните химически процедури за разделяне на липидната фракция е Kaluzny et al. [27] Метод SPE, който позволява да се получат три липидни фракции: AG, PL и FFA. Участието на определени липидни фракции в HFD мишки се променя в сравнение с мозъка на SD мишки (Фиг. 3). При HFD мишки установихме статистически значимо увеличение на фракцията на AG (фиг. 3), което се състои главно от диацилглицероли (DAG) и триацилглицероли (TAG) [39]. Повишените нива на AG могат да се отдадат на по-високо ниво на MUFA при HFD мишки (Таблица 3). Също така, повишените нива на ацилглицероли са наблюдавани от Borg et al. [39], в хипоталамуса на HFD мишки в сравнение с животни, хранени с диета с ниско съдържание на мазнини. DAG е продукт на метаболизма както на фосфолипидите, така и на TAG и е замесен в развитието на централна инсулинова резистентност в мозъка [39].

Доминиращ PUFA сред SM фракцията е DHA, който играе значителна роля в сигнализирането на клетките като компонент на липидните салове [48]. Също така, поради по-голямата гъвкавост на DHA, той е по-лесно включен в гликосфинголипидната мембрана [49]. Във фракцията GSPL и Cer нивата на EPA и DHA са значително по-ниски от нивото на ARA (Таблица 3). За разлика от DHA и ARA, във всяка определена сфинголипидна фракция наблюдаваме значително намаляване на нивата на EPA в мозъка на HFD мишки (Таблица 3). Една от причините за намалено съдържание на EPA в мозъка на мишки след HFD може да бъде по-ниската му наличност в кръвта. Освен това другите причини за по-ниски нива на EPA могат да бъдат участието на EPA в липидния метаболизъм в мозъка, включително β-окисление, удължаване/десатурация до докозапентаенова киселина (22: 5n-3; DPA), която е предшественик на DHA [50 ]. EPA е толкова важна киселина не само поради гореспоменатите свойства, но също така влияе върху функционирането на мозъка. Изследвания върху мозъка на плъхове показват, че EPA се увеличава в кортикалните тъкани, подобрява пространствената памет при възрастните плъхове и възстановява логарифмичното потенциране [51]. Гореспоменатите данни предполагат, че намалените нива на EPA в PL и сфинголипидите в мозъка на HFD мишки могат да допринесат за мозъчна дисфункция.

Промени на PUFA/EPA в други органи на мишки

Консумацията на храна в мазнини води до увеличаване на мазнините и увеличаване на телесното тегло, особено диети, съдържащи повече от 30% от общата енергия, тъй като мазнините водят до развитие на затлъстяване [52]. Съобщава се обаче, че не всяка мазнина е обезогенна и профилът на мастните киселини, а не енергията от мазнини, е от решаващо значение за развитието на затлъстяване [52]. От друга страна, някои проучвания не показват разлики между наддаването на телесно тегло на животните, консумиращи храна, съдържаща различни мастни киселини [52].

Някои автори описват повишени нива на TAG и FFA в серумни мишки след диета с високо съдържание на мазнини [53, 54]. TAG и FFA са отговорни за индуцирането на оксидативен стрес, липотоксичност, дислипидемия, инсулинова резистентност и диабет [55]. Също така, нашето проучване показа значително повишени серумни общи мастни киселини, които евентуално са включени както в TAG, така и във фракции на FFA. Прекомерното отлагане на липиди в клетки, различни от адипоцитите, води до клетъчен стрес, дисфункция и понякога до апоптотична клетъчна смърт, наречена липотоксичност. Този процес участва в развитието на много заболявания [39]. Съставът на мастните киселини на различни липиди често отразява състава на мастните киселини в консумираната храна [56]. Въпреки това, въпреки че концентрацията на общия FA в чау с високо съдържание на мазнини е четири пъти по-висока, отколкото в стандартната чау (таблица 2), нивата на EPA са значително намалени в серума и всички анализирани органи на HFD мишки (таблици 2, 3).

Значителни разлики в съдържанието на EPA в депата на черния дроб и три мастни тъкани (Таблица 2) също могат да доведат до увеличаване на секрецията на адипонектин в мастната област [57], което може да увеличи риска от съпътстващи заболявания на затлъстяването, включително сърдечно-съдови заболявания и инсулинова резистентност [58] . Нещо повече, адекватното количество EPA в приемната диета предотвратява затлъстяването чрез индуциране на митохондриална биогенеза и бета-окисление в адипоцитите [59].

Заключения

Нашето проучване показа, че за разлика от други PUFA, западната диета причинява значително намаляване на съдържанието на EPA в мишки серум, мозък и други тъкани. В мозъка намаляването на EPA е значително сред фосфолипидите и сфинголипидите, които са основни компоненти на клетъчните мембрани. Намаленото EPA в мозъка след HFD може да е резултат от намалената наличност на този FA от кръвта или превръщането му в други FA в мозъчните клетки. Намалените нива на EPA в мозъка могат да доведат до повишено възпаление, структурни промени в клетъчните мембрани и съответно до нарушена мозъчна функция.

Наличност на данни и материали

Споделянето на данни не е приложимо за тази статия, тъй като по време на текущото проучване не са генерирани или анализирани набори от данни.