Malgorzata E. Skaznik-Wikiel

3 Отдел по репродуктивна ендокринология и безплодие, Катедра по акушерство и гинекология, Медицински факултет на Университета в Колорадо, Аврора, Колорадо

Дилейни С. Суиндъл

3 Отдел по репродуктивна ендокринология и безплодие, Катедра по акушерство и гинекология, Медицински факултет на Университета в Колорадо, Аврора, Колорадо

Аманда А. Allshouse

4 Катедра по биостатистика и информатика, Колорадо училище за обществено здраве към Университета на Колорадо Денвър, Аврора, Колорадо

Алекс Й. Полоцки

3 Отдел по репродуктивна ендокринология и безплодие, Катедра по акушерство и гинекология, Медицински факултет на Университета в Колорадо, Аврора, Колорадо

Джеймс Л. Макманаман

5 Отдел по репродуктивни науки, Катедра по акушерство и гинекология, Медицински факултет на Университета в Колорадо, Аврора, Колорадо

Свързани данни

Резюме

Прекомерната консумация на калории, особено при диета с високо съдържание на мазнини, е рисков фактор както за затлъстяването, така и за репродуктивните нарушения. Изследванията върху животински модели показват, че повишените хранителни мазнини могат да повлияят на някои репродуктивни функции, независимо от затлъстяването. В настоящото проучване се опитахме да определим дали диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) влияе върху функцията на яйчниците, дългосрочната плодовитост и локалните и системни маркери на възпалението, независимо от затлъстяването. Пет седмични мишки са били хранени или с диета с ниско съдържание на мазнини (контролна група-LF-Ln), или с HFD в продължение на 10 седмици и са разделени на базата на телесното тегло на затлъстели с високо съдържание на мазнини (HF-Ob:> 25 g) и мазнини постно (HF-Ln: Ключови думи: плодовитост, диета с високо съдържание на мазнини, възпаление, яйчници

ВЪВЕДЕНИЕ

Затлъстяването е силно разпространено, особено в развития свят. Изчислено е, че към края на 2015 г. 41% от възрастните в САЩ са били със затлъстяване, както е определено от индекса на телесна маса по-голям от 30 kg/m 2 [1]. Затлъстяването е често срещан проблем сред жените в репродуктивна възраст и е свързано с множество репродуктивни неблагоприятни ефекти, включително ановулация, нередовна менструация, безплодие, спонтанен аборт и неблагоприятни резултати при бременност с асистирани и спонтанни зачатия [2]. Въпреки че е доказано, че загубата на тегло от 10% увеличава зачеването и раждаемостта при жени със затлъстяване в ретроспективни проучвания [3], все още няма намеса, която да е доказана последователно, за да нормализира клиничната честота на бременност при жени със затлъстяване.

Разбирането на затлъстяването и излагането на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и тяхното въздействие върху репродуктивната функция на жените е важно за разглеждане на превантивните мерки за подобряване на резултатите. Затлъстяването е свързано с хормонални и метаболитни дисбаланси, свързани с взаимодействията между генетични и екологични фактори [4, 5]. Към днешна дата индивидуалният и комбинираният принос на хормонални, метаболитни и екологични влияния върху репродуктивната дисфункция на затлъстелите индивиди остават слабо разбрани. Прекомерната консумация на калории, особено диета с високо съдържание на мазнини, е рисков фактор както за затлъстяването, така и за репродуктивните нарушения [6, 7]. В яйчниците от мишки, хранени с HFD в продължение на 4 седмици, както кумулусните клетки, така и ооцитите съдържат значително повишени нива на неутрален липид [8], а при жените затлъстяването е свързано с драстично увеличение на нивата на триглицеридите на фоликуларната течност [9].

Изследвания на модели на мишки показват, че повишената консумация на мазнини в храната може да повлияе на някои репродуктивни функции, независимо от затлъстяването [9]. Например, скорошно проучване предполага, че излагането на HFD от едва 6 седмици има необратим ефект върху качеството на яйцеклетките [10]. Важното е, че специфичният принос на повишените хранителни мазнини спрямо затлъстяването към дисфункцията на яйчниците остава неясен. Възпалителните отговори изглежда играят решаваща роля в липотоксичната дисфункция на ооцитите. Множеството серумни цитокини са повишени при затлъстяване, особено фактор на туморна некроза-α (TNF-α) и интерлевкин-6 (IL-6) [11, 12]. Нискостепенното системно възпаление е свързано с развитието на безплодие и други свързани със затлъстяването неблагоприятни репродуктивни резултати [6, 13]. Не е ясно обаче дали излагането само на HFD, без фенотипа със затлъстяване, води до подобни локални и системни смущения.

Целта на това проспективно проучване върху животни е да се определи дали HFD повлиява функцията на яйчниците, дългосрочната плодовитост и маркерите на възпалението, независимо от затлъстяването. Ние предположихме, че продължителното излагане на HFD би имало вреден ефект върху функцията и физиологията на яйчниците независимо от фенотипа на затлъстяването. За да тестваме тази хипотеза, поставихме млади мишки C57BL/6J върху HFD в продължение на 10 седмици и сравнихме броя на фоликулите им с тези, които се поддържат на контролна диета с ниско съдържание на мазнини (LFD). Също така оценихме локални и системни маркери за възпаление и резултатите от бременността в 5-месечно развъдно проучване. Нашите данни разкриват, че HFD причинява значително намаляване на първоначалните фоликули, нарушава плодовитостта, произвежда по-високи нива на възпалителни цитокини и увеличава инфилтрацията на яйчниците в макрофагите, независимо от затлъстяването.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Анализ на животни, диета и състав на тялото

Събиране на тъкани и оценка на глюкозата на гладно

Мишките бяха гладувани в продължение на 6 часа. Кръвни проби бяха събрани от опашната вена и нивата на глюкоза бяха измервани с помощта на система за мониторинг на глюкозата в кръвта ReliOn (Ultima). Яйчниците бяха събрани за оценка на фоликулния фонд на яйчниците (първичен и нарастващ) и за определяне на степента на локално възпаление (инфилтрация на макрофаги). Серумът се събира за измерване на системни нива на цитокин и анти-Мюлериански хормон (AMH).

Опити за чифтосване

Пет седмични женски мишки бяха поставени върху HFD, описан в раздела за диета и хранене. Мишките са били хранени с тази диета изключително за 10 седмици. На 15 седмици на възраст женските мишки (6 на група за хранене) бяха поставени с нокаут C57BL/6J перилипин-2 мъже с известна плодовитост. Мъжки нокаутиращи мишки перилипин-2 са устойчиви на затлъстяване и не развиват свързани със затлъстяването здравословни проблеми, включително безплодие [17]. Броят на котилата, броят на малките на едно котило и теглото при раждане на всяко кученце от пет последователни опити за разплод, проведени в продължение на 5 месеца. В този момент животните бяха жертвани. Яйчниците бяха събрани, за да се направи оценка на фоликула на яйчниците (първичен и растящ) и да се определи степента на локално възпаление (инфилтрация на макрофаги). Събира се серум за измерване на неестерифицирани мастни киселини, циркулиращи цитокини и AMH.

Анализ на серумен цитокин

Колориметрични тестове бяха използвани за измерване на серумни нестерифицирани свободни мастни киселини (NEFA; Wako Chemicals USA, Richmond, VA). Серумни нива на адипонектин (MADPNMAG-70K-01), IL-8, IL-10, интерферон-гама (IFN-гама), гранулоцитен макрофагичен колоний-стимулиращ фактор (GM-CSF) (MCYTOMAG-70K-04); лептин, инсулин, TNF-алфа и IL-6 (MADKMAG-71K-04) бяха оценени с помощта на Milliplex Multiplex Luminex тестове (EMD Millipore, Concord, MA) в съответствие с инструкциите на производителя за всеки анализ. Минималните откриваеми концентрации на всеки анализ и коефициентът на вариация между анализите и интра-анализът са представени в допълнителна таблица S2.

Анализ на нивото на серумния AMH

Серумът се събира след 32 седмици по съответните диети и AMH се измерва в Университета на Вирджиния Център за изследване в репродуктивния анализ и анализ на ядрото (Charlottesville, VA) с помощта на ELISA. Чувствителността на анализа е 0,2 ng/ml, средният докладван диапазон е 0,2 до 15 ng/ml, а коефициентите на вариация между и в рамките на анализа са съответно 3,6% и 8,5%.

Брой на фоликулите

Извършен е диференциален брой на фоликулите, както е описано по-рано [18], за да се оцени ефектът от HFD върху яйчниковия резерв. Накратко, десният яйчник се събира след 10 седмици на съответната диета и се фиксира в разтвор, съдържащ 0,34 N ледена оцетна киселина, 10% формалин и 28% етанол и се влага в парафин. Цели яйчници бяха разделени серийно (8-μm сечения) и оцветени с пикринова киселина/метилово синьо и хематоксилин на Weigert. Броят на почиващите (първични) и нарастващите (първични, вторични, антрални) фоликули на яйчник е определен, както е описано по-рано от Tilly et al. [18]. Накратко, броят на диференциалните фоликули се изчислява след преброяване на всяка пета секция. Бяха преброени само фоликули с видимо ядро ​​в даден участък, за да се избегне надценяване на по-големия брой фоликули. След това полученият брой се умножава по пет за всеки тип фоликул (първичен, първичен, вторичен, антрален), за да се изчисли общият брой фоликули на яйчник. Съотношението на растеж към първичен фоликул също беше оценено за всички експериментални групи. Всички преброявания се извършват от проверяващ, заслепен за експерименталните групи. Средните разлики в броя на първичните и растящите фоликули, направени от двама заслепени, независими наблюдатели за всички видове клетки, са в рамките на 10%.

Имунохистохимия за макрофагов маркер CD68

Брой на макрофагите

Преброяването на макрофагите се извършва, като се използват четири представителни участъка от средата на яйчника и броят се осреднява. CD68-положителните клетки бяха преброени. Анализирани са шест яйчника на експериментална група.

Статистически анализ

За броя на фоликулите, броя на макрофагите, нивата на глюкоза на гладно, NEFA и цитокините се определя статистическа значимост чрез използване на еднопосочен ANOVA с тест Bonferroni post hoc. Всички мерки са средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера STATA версия 13 (StataCorp LP, College Station, TX). Стойността на P по-малка от 0,05 се счита за статистически значима. Всеки път, когато настъпи бременност, се записва броят на малките в едно котило. Разликите между групите в честотата на бременността са моделирани с течение на времето, като се използва функция на логит линк в рамките на общ линеен модел на смесени ефекти [20], като по този начин се изчислява логистичен модел на смесени ефекти [16]. Разликите в броя на малките на едно котило са моделирани във времето, като се използва функция на отрицателна биномна връзка в рамките на общ линеен модел на смесени ефекти. Общият брой на малките и общият брой бременности през 5-те месеца са обобщени като среден и 95% интервал на доверие от регресията на Поасон и са сравнени в рамките на модела на Поасон. За статистически анализи е използван софтуер SAS версия 9.4; Призма версия 6.03 е използвана за създаване на графики (GraphPad).

РЕЗУЛТАТИ

Характеристики на състава на тялото

Брой на фоликулите

мазнини

Първичен и нарастващ брой на фоликулите на яйчник. Броят на фоликулите се оценява след 10 и 32 седмици по съответните диети. Графиките представляват броя на първичните (A и Б.) и расте (° С и д) фоликули на яйчник в различни групи с диетична интервенция в две времеви точки. Графики Е. и F представляват съотношение на нарастващи към първични фоликули на яйчник след 10 и 32 седмици на диета. Пръчките представляват средна стойност ± SEM (n = 6 мишки на група; един яйчник на мишка); * статистически значими разлики от групата LF-Ln; P Фиг. 4). Тези констатации са потвърдени от количествена оценка, която разкрива увеличен брой макрофаги в яйчниците от HFD животни в сравнение с LFD животни, както след 10, така и 32 седмици на HFD. Средният брой макрофаги на участък е 11,8 ± 4,1 при LF-Ln мишки, 41,8 ± 6,3 при HF-Ln мишки и 47,5 ± 15,7 при HF-Ob мишки (P Таблица 1). GM-CSF беше увеличен както при HF-Ln, така и при HF-Ob животни, докато лептинът и IL-8 бяха увеличени само при затлъстели животни. Няма разлики в нивото на адипонектин (противовъзпалително), IL-6, IL-10 и IFN-гама сред групите. След 32 седмици на диета, GM-CSF отново е повишен при HF-Ln и HF-Ob животни в сравнение с този при LF-Ln мишки, въпреки че разликите не достигат статистическа значимост. Противно на по-ранната точка от време, лептинът и IL-8 бяха повишени не само при HF-Ob животни, но и при LF-Ln животни. Не са установени разлики в нивата на адипонектин, IL-6, IL-10, TNFα и IFN-гама между групите (Таблица 2).

МАСА 1

Системни нива на цитокини след 10 седмици на диета.