Допринесе еднакво за тази работа с: Min Wu, Lin Sun

lymphoma

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Допринесе еднакво за тази работа с: Min Wu, Lin Sun

Западна китайска болница, Университет Съчуан, Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Партньорски отдел по патология и лабораторна медицина, Университет на медицински център в Канзас, Канзас Сити, KS, Съединени щати

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

Фармацевтичен отдел, Медицински колеж в Ченгду. Ченгду, провинция Съчуан, Китай

  • Мин Ву,
  • Лин Слънце,
  • Ziyan Yuan Pessetto,
  • Zhihe Zang,
  • Xingliang Xie,
  • Линг Чжун,
  • Цин Су,
  • Уанг Зан,
  • Ксиуронг Гао,
  • Ян Джао

Фигури

Резюме

Casitas b-линеамният лимфом (c-Cbl) е важен протеинов адаптер с присъща активност на E3 убиквитин лигаза, която взаимодейства с E2 протеини като UbCH7. c-Cbl играе жизненоважна роля в регулирането на рецепторната тирозин киназна сигнализация. c-Cbl участва в енергийната хомеостаза на цялото тяло, което го прави потенциална цел за лечение на диабет тип 2 и затлъстяване. В настоящото проучване ние сме проектирали два родителски пептида и 55 модифицирани пептиди въз основа на структурата на UbCH7 контур L1 и L2. Тринадесет от модифицираните пептиди показват повишена инхибиторна активност при анализ, базиран на флуоресцентна поляризация. В принципа на in vivo доказателство за изследване, мишките, третирани с пептиди 10, 34, 49 и 51, са били защитени срещу затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини и устойчиви на инсулин. Тези инхибитори могат потенциално да доведат до нови терапевтични алтернативи за затлъстяване и диабет тип 2.

Цитат: Wu M, Sun L, Pessetto ZY, Zang Z, Xie X, Zhong L, et al. (2015) Casitas B-Lineage Lymphoma RING Domain Инхибитори предпазват мишките от затлъстяване и инсулинова резистентност, предизвикани от диета с високо съдържание на мазнини. PLoS ONE 10 (8): e0135916. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0135916

Редактор: Юджийн А. Пермяков, Руска академия на науките, Институт за биологични инструменти, РУСКА ФЕДЕРАЦИЯ

Получено: 17 октомври 2014 г .; Прието: 28 юли 2015 г .; Публикувано: 21 август 2015 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Този проект беше подкрепен от Националната научна фондация за изявени млади учени на Китай (грант № 81102326), Ченгду Медицински колеж за Програма за развитие на големите фармацевтични изследвания (грант № CYXK2012006) и от програма за иновационен изследователски екип на провинциалните университети в провинция Съчуан ( № 13TD0028). Авторите благодарят на членовете на лабораторията на Слънцето за полезните дискусии. Тази работа беше подкрепена и с безвъзмездна помощ от CTSA от NCATS, предоставена на Медицинския център за граници на Университета в Канзас: Институтът за клинични и транслационни изследвания на Хартланд # KL2TR000119. Съдържанието е отговорност единствено на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на NIH или NCATS.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Установено е, че c-Cbl A/- (C379A) ​​мишки, експресиращи мутация в RING пръстовия домейн на c-Cbl протеин, имат много сходен фенотип в сравнение с c-Cbl -/- мишки. c-Cbl A/- мишките са намалили нивата на мастна тъкан, инсулин, лептин и триглицериди в сравнение с мишки от див тип [4]. Те също така имат подобрен глюкозен толеранс в сравнение с мишки от див тип [4]. Наблюдава се повишена консумация на кислород. Изследователите изследваха мишки, експресиращи мутант c-Cbl с PI3K свързващ домен аблация (c-Cbl F/F) мишки. Тези мишки (c-Cbl F/F) показват сходна инсулинова чувствителност, телесен състав и енергиен разход в сравнение с контролните мишки от див тип [2–4]. Следователно, тези данни предполагат, че именно активността на c-Cbl убиквитин лигазата играе важна роля в регулирането на енергийния метаболизъм на цялото тяло [4]. Всички тези данни подчертават, че c-Cbl е обещаваща терапевтична цел за затлъстяване и диабет тип 2. Тук предлагаме да се генерират инхибитори на домейн c-Cbl RING, които могат функционално да имитират мутация на домейн c-Cbl RING и да нокаутират функцията на c-Cbl убиквитация чрез пептидомиметичен подход. Предполагаме, че инхибиторите на c-Cbl ще предпазят мишките от затлъстяване и инсулинова резистентност, предизвикано от диета.

Убиквитинацията изисква последователни действия на три ензима: (i) активиращият ензим (Е1) образува високоенергийна тиоестерна връзка с убиквитин карбоксилната група на G76, като по този начин активира С-края на убиквитина; (ii) конюгиращ ензим (Е2), който има активни цистеинови остатъци, се набира и пренася временно активирания убиквитин; (iii) лигаза (Е3) след това прехвърля активирания убиквитин от Е2 към субстратния лизинов остатък [7]. Тук предлагаме да проектираме инхибитори към свързващия интерфейс E2 – E3. E2 – E3 (протеин-протеин) интерфейси са плоски и експанзивни; няма добре дефиниран джоб, като например с ензимно активни места. Следователно, тази топология улеснява множество партньори за сигнализиране да се свързват към един и същ сайт [8]. Молекулите, получени от естествени или биоактивни, са добри кандидати за скрининг. Чрез засилване на водородното свързване, хидрофобните или електростатичните взаимодействия между пептидите и протеините, ефикасността на тези пептиди може да се увеличи значително. [9].

Разтворимостта във вода, липофилността, химическата стабилност и метаболитната стабилност (протеолитично и ензимно разграждане) често определят бионаличността и биоразпределението на пептидните инхибитори. Поради присъщите физикохимични свойства, пептидите, съставени от естествени аминокиселини, не са много добри кандидати. Известно е, че тези пептиди имат ниска стабилност в плазмата. Те също са чувствителни към протеази и могат да бъдат изчистени от кръвообращението за няколко минути [10]. Стратегиите за подобряване на активността и стабилността на пептидните инхибитори включват ограничаване на пептида до свързаното потвърждение, циклизиране на пептида, биостерично заместване на пептидните връзки, промяна на стереохимията на аминокиселините (D конформация) и ограничаване на пептидния край [11-17] . Следователно ние предложихме да използваме защитени с Fmoc аналози на аминокиселини, за да изследваме ролята на всеки остатък и да увеличим активността.

Материали и методи

Пептиди и протеини

Пептидите и пептидните миметици са закупени от MitenChem (Китай) с чистота ≥ 98%. Стойностите на концентрациите на възстановените пептиди бяха определени чрез анализ на аминокиселини в съоръжението за протеиново ядро ​​(Chengdu Medical College). Рекомбинантният протеин Cbl е произведен от ядрото за протеини Core Chengdu Medical College и е описан по-рано [9]. Протеинът c-Cbl (RING), включително линкерът и RING домейнът (кодон 358–457), беше маркиран с глутатион S-трансфераза (GST) и пречистен с GSH-сефароза (Shanghai Biopharma) [9].

Анализ на флуоресцентна поляризация (FP)

FP анализът е разработен и валидиран по-рано [9]. Накратко, маркирана с флуоресцеин сонда (FITC-βA-PFKPP-NH2, 100 nmol/L) и Cbl (RING) протеин (3 μmol/L) бяха смесени и разредени до крайната концентрация, използвайки 0,01% Triton X-100 в PBS ( рН = 7,4). След това във всяка реакционна ямка се зареждат 19 μl от тази основна смес. След това пептидите или пептидните миметици бяха заредени в определените ямки (1 μl, 10 μmol/L - 0.078 μmol/L, полукратни разреждания). Стойностите на общата флуоресценция и поляризация бяха измерени при дължина на вълната на възбуждане 485 nm и дължина на вълната на излъчване 538 nm, като се използва четец на плочи ZS-2. Данните бяха монтирани и стойностите на ΔmP, Kd и Ki бяха оценени, използвайки SigmaPlot 11.0.

Проучвания in vivo [2–4, 18].

Всички експерименти са одобрени от институционалния комитет за грижи и употреба на животните (Chengdu Medical College, Китай). Всички експерименти бяха проведени на 10-седмични мъжки мишки, поддържани на фона на C57BL/6. Всички животни бяха държани на 12-часов цикъл светлина/тъмнина със свободен достъп до храна и вода.