Резюме

Възпалителните състояния на стомашно-чревния тракт са значителна причина за заболеваемост и смъртност в световен мащаб. Състояния като инфекциозен колит и възпалително заболяване на червата предизвикват ерозия и улцерация на лигавичните тъкани и нарушена стомашно-чревна функция. По време на появата на увреждане и възпаление на лигавицата се инициира сложен набор от възпалителни сигнали, включващи производството на PG и цитокини (1). Подгрупи от цитокини, включително IL-8, IFN-γ и TNF-α, нарушават чревната епителна функция и водят до набиране на възпалителни клетки до местата на увреждане (2). Например, доказано е, че IFN-γ и TNF-α влошават чревния транспорт на епителните йони и предизвикват разглобяване на междуклетъчните връзки и апоптоза (3, 4, 5). IL-8 е мощен рекрутер на левкоцити (6). Въпреки това, едновременното активиране на защитни механизми служи за регулиране на степента на възпаление и тежестта на нараняване. Разработването на различни фактори, включително IL-11 и индуцируема NO синтаза, е от решаващо значение за защитния механизъм на чревната лигавица за поддържане на функционална цялост (1, 7, 8, 9).

нараняването

AnxA1 е зависим от калций фосфолипиден свързващ протеин, за който първоначално се съобщава, че се индуцира от глюкокортикоиди и инхибира фосфолипазната активност (10, 11). Впоследствие е показано, че AnxA1 регулира различни клетъчни функции в различни клетъчни типове и проявява дълбоки инхибиторни действия върху трансмиграцията и активирането на левкоцитите (12, 13). Защитна и противовъзпалителна роля на AnxA1 е демонстрирана в модели на ендотоксемия, перитонит, артрит, както и церебрална и миокардна исхемия (13, 14, 15, 16, 17, 18, 19). Проучванията in vitro от нашата група включват роля за AnxA1 в стимулирането на миграцията на моделна чревна епителна клетъчна линия, важна за регенеративните лигавични отговори (20). В съответствие с тези констатации, скорошни проучвания са идентифицирали ролята на AnxA1 за насърчаване на зарастването на индуцирани от индометацин язви на стомаха (21).

В допълнение към неговите фосфолипазни инхибиторни действия, доказано е, че защитните и противовъзпалителни свойства на AnxA1 се медиират чрез сигнализиране чрез формил пептидни рецептори (FPR). 4 По-специално, доказано е, че защитният ефект на AnxA1 при модели на миокардна исхемия е чувствителен към антагонизма на FPR (18). В допълнение, инхибирането на функцията на левкоцитите и насърчаването на заздравяването на стомашна лигавица се приписва на стимулиране на ALX/FPRL-1 от AnxA1 (22, 23). ALX/FPRL-1 се експресира в чревни епителни клетки, където е доказано, че регулира противовъзпалителната сигнализация (24, 25). Интересното е, че секрецията на AnxA1 е идентифицирана в възпалени чревни лигавични тъкани (26, 27); функционалната значимост на това събитие обаче все още не е определена. Поради това се опитахме да определим ролята на AnxA1 за модулиране на увреждане и възпаление на чревната лигавица. Използвайки нокаутиращи животни AnxA1, ние демонстрираме, че липсата на експресия на AnxA1 води до повишена чувствителност към остър декстран сулфат натрий (DSS) -индуциран колит, както и нарушено възстановяване след отнемане на DSS. Освен това, нашите открития също така включват критична роля за ALX/FPRL-1 в медиирането на защитните ефекти, предоставени от AnxA1 по време на възпалителния процес.

Материали и методи

Животни

Женски мишки BALB/c от див тип (WT) са закупени от лабораторията The Jackson. Нулевите мишки на AnxA1 са генерирани, както е описано по-горе (28). Животните се поддържат на 12-часов светлинен/12-часов тъмен цикъл при условия, свободни от патогени. Мишките имаха свободен достъп до стандартна диета и вода до достигане на желаната възраст (8–10 седмици) и/или тегло (20–25 g). Всички процедури с използване на животни бяха прегледани и одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета Емори и бяха извършени в съответствие с критериите, посочени от Националния здравен институт.

Индукция на колит

Седем процента (w/v) DSS (молекулна маса, 36-50 kDa; MP Biomedicals) се разтваря в пречистена вода и се прилага на мишки в продължение на 7 дни (29). За спасителни проучвания със стимулация ALX/FPRL-1 използвахме 15-епи-липоксин А4 ((5S, 6R, 15R) -5,6,15-трихидрокси-7,9,13-транс-11-цис-ейкозатетраенова киселина; Calbiochem), който е инжектиран ip (0,4 μg/животно) дневно по време на приложението на DSS.

Уестърн блотинг

Лигавичните тъкани, отстранени ръчно от дебелото черво на мишки, използвайки стереомикроскопия, или клетъчни монослоеве се поставят в лизисен буфер (100 mM KCl, 3 mM NaCl, 3,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) и 1% Triton X-100), съдържащи протеаза и фосфатазни инхибитори (Sigma-Aldrich). Лизатите се удвояват и неразтворимият материал се отстранява чрез центрофугиране (16 000 × g/10 min/4 ° C). Изчистените лизати се нормализират за концентрация на протеин, смесват се с редуциращ буфер за проби на Laemelli (съдържащ 20 mM DTT крайна концентрация) и се подлагат на SDS-PAGE. Протеините се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани и се имуноблотират, използвайки заешки анти-анексин 1 и актин Abs.

Имунофлуоресценция

Проби от тъкан на дебелото черво за имунофлуоресценция са вградени в O.C.T. (Sakura) и криосекция (5 μm дебелина). След това тъканните секции бяха фиксирани в 3.4% параформалдехид за 20 минути при стайна температура и измити с HBSS +. След това секциите бяха проникнати с 1% Triton X-100 в HBSS +, измити, след това блокирани в HBSS +, съдържащи 3% BSA за 1 h при стайна температура. След инкубация за 1 h с първичен Abs в 3% блокиращ BSA буфер, срезовете се измиват, инкубират се за 1 h с конюгиран с Alexa багрилен вторичен Abs, измиват се и след това се инкубират с To-Pro-3 йодид за визуализиране на ядрата. Секциите бяха монтирани в р-фенилен-диамин и анализирани с помощта на лазерно сканиращ конфокален микроскоп Zeiss LSM510 (Zeiss). Интегриран анализ на интензитета на пикселите беше извършен с помощта на софтуера за анализ на изображения Zeiss LSM 510 (V 4.03). Изображенията за този анализ са направени при идентични настройки на усилването на детектора.

Оценка на възпалението при мишки, лекувани с DSS

Ежедневната клинична оценка на третирани с DSS животни включва измерване на телесно тегло, оценка на консистенцията на изпражненията и наличие на кръв в изпражненията чрез тест с хартия с гваяк (Hemoccult Sensa; Beckman Coulter). Утвърден индекс на активност на клиничната болест (DAI), вариращ от 0 до 4, беше изчислен, като се използват следните параметри: консистенция на изпражненията, наличие или липса на фекална кръв и процент на загуба на тегло (30). Мишките се умъртвяват на 7-мия ден или 7-ия ден след оттеглянето на DSS и дебелото черво се отстранява. Дължината и теглото са измерени (31) след изключване на цекума и преди разделяне на дебелото черво за хистология и оценка на активността на миелопероксидазата (MPO) (32).

MPO активност на тъкани

MPO активността се измерва в тъкан, съседна на използваната за хистология. Пробите се изплакват със студен PBS, попиват се на сухо и незабавно се замразяват в течен азот. Те се съхраняват при -80 ° C, докато се изследва MPO активност, използвайки метода на о-дианизидин (33, 34).

Хистология

Повишена експресия на AnxA1 в тъканите на лигавицата на дебелото черво след DSS лечение. Western blot анализът на лигавиците на лигавиците от нелекувани и третирани с DSS животни WT BALB/c (A) разкрива повишен протеин AnxA1. Въз основа на денситометричния анализ на Western blots от тези проучвания (B), нивата на AnxA1 са увеличени 1,5 пъти след DSS лечение (∗, p-стойност ⇓ A, стрелки). Мононуклеарните клетки в lamina propria също експресират AnxA1 (фиг. 2 ⇓ A, върхове на стрелки). В повърхностните ентероцити AnxA1 е открит по протежение на апикалната и страничната мембранни плазматични мембрани, както и в цитоплазматичния отдел (фиг. 2 ⇓ B). За разлика от това AnxA1 е идентифициран предимно в цитоплазмата на криптния епител (фиг. 2 ⇓ С). След DSS лечение, AnxA1 беше регулиран нагоре както в повърхностните, така и в епителните клетки на криптата (фиг. 2 ⇓, B-E; изображенията бяха заснети при идентични настройки на усилването на детектора). Въз основа на интегриран анализ на интензитета на пикселите, епителът показва 1,6-кратно увеличение на нивата на AnxA1 при третирани с DSS животни в сравнение с нетретирани контроли (Фиг. 2 ⇓ F; ∗, p-стойност

Експресията на AnxA1 се увеличава в чревните епителни клетки след лечение с DSS. Имунофлуоресцентният анализ на лигавицата на WT BALB/c разкрива експресия на AnxA1 както в криптата, така и в повърхностните чревни епителни клетки (A; стрелки) [Bar = 50 μm]. В повърхностните ентероцити (В) AnxA1 се локализира в апикалната и страничната плазматични мембрани, както и в цитоплазмата, докато в епителните клетки на криптите изглежда, че е изключително в цитоплазмата (С) [Барове = 20 μm]. След DSS лечение нивата на AnxA1 се повишават както в повърхностните, така и в епителните клетки на криптата в сравнение с нелекуваните животни (B – E; изображения, направени при идентични настройки на усилване на детектора) [Барове = 20 μm]. Интегрираният анализ на интензитета на пикселите (F) разкрива 1,7-кратно увеличение на нивата на AnxA1 в чревните епителни клетки след 7 дни лечение с DSS (∗, p-стойност ⇓ A, по-изразена загуба на тегло се наблюдава при мишки AnxA1 (-/-) в рамките на 3 дни след прилагането на DSS в сравнение с третирани с DSS WT животни (* p-стойност ⇓ B; ∗, p-стойност ⇓ C; ∗, p-стойност ⇓ D; ∗, p-стойност ⇓ A, представителни фотомикрографии на H & E- оцветените разрези разкриват по-голяма степен на увреждане на епитела, повишена инфилтрация на неутрофили и възпалителни промени в субмукозните тъкани (стрелки) на AnxA1 (-/-) мишки в сравнение с WT животни след 7 дни лечение с DSS. Така, DSS-третиран AnxA1 (-/-) животните са показали повишен хистологичен резултат на нараняване и MPO активност в лигавичните тъкани в сравнение с контролите (Фиг. 4 ⇓, B и C; *, p-стойност

Мишките с дефицит на AnxA1 показват нарушено клинично и хистопатологично подобрение след прекратяване на лечението с DSS. AnxA1 (-/-) мишки показаха значително намаляване на скоростта на увеличаване на теглото след оттегляне на DSS лечението в сравнение с WT контролите (A; ∗, p-стойност ⇓ A, лечение на AnxA1 (-/-) животни с 15-epi -липоксин А4 в хода на администриране на DSS води до подобна загуба на тегло на контролите, третирани с WT DSS. Интересното е, че не се наблюдава значително подобрение в загубата на тегло поради DSS лечение при WT BALB/c животни. DAI резултатът за AnxA1 ( -/-) животни е значително по-висока от тази на контролите, а лечението с 15-епи-липоксин А4 води до DAI резултати, подобни на тези на третирани с WT DSS животни (фиг. 6 ⇓ B). Не се наблюдава подобрение на DAI при WT животни, лекувани с 15-епи-липоксин A4 в сравнение с WT животни, лекувани само с DSS.Накрая, хистопатологичният анализ демонстрира значително подобрение на нараняването на лигавицата поради прилагане на DSS при 15-епилипоксин A4, третирани AnxA1 (-/-) в сравнение с тези, получаващи само DSS (фиг. 6 ⇓, C и D). В WT животни, лекувани с DSS, едновременно лечение с 15-епи-липоксин А4 не е довело до статистически значимо подобрение в резултата за хистологично нараняване (фиг. 6 ⇓, C и D). По този начин, в отсъствие на AnxA1, стимулирането на ALX/FPRL-1 е ефективно за намаляване на тежестта на DSS-индуцирано заболяване, аналогично на това, наблюдавано при контролите на WT. В присъствието на AnxA1 (при WT мишки), ALX/FPRL-1 стимулация с настоящия протокол и лиганд не подобрява хода на заболяването.

Стимулацията ALX/FPRL-1 спасява чувствителността на мишки с дефицит на AnxA1 към индуциран от DSS колит. AnxA1 (-/-) животни демонстрираха по-изразена загуба на тегло след DSS лечение, което беше възстановено до това на WT контролите с ALX/FPRL-1 стимулация чрез прилагане на 15-епи-липоксин A4 (обозначен като L на фигурата) (A; *, P-стойност ⇓ A; *, p-стойност ⇓ A). След прилагането на DSS, AnxA1 (-/-) животни показват по-голяма степен на потискане на експресията на ALX/FPRL-1 в сравнение с WT животни, средно 4,7 пъти по-малко от третирани с DSS животни WT (Фиг. 7 7 A). За FPR-rs2 не е открита разлика в експресията между контролните WT, третирани с DSS WT и контролните AnxA1 (-/-) животни (Фиг. 7 ⇓ B). След 7 дни лечение с DSS обаче, експресията на FPR-rs-2 беше драстично намалена само при AnxA1 (-/-) животни (фиг. 7 ⇓ B; ∗, p-стойност ⇓ C). По този начин мишките AnxA1 (-/-) показват намаляване на ALX/FPRL-1 и по-специално експресия на FPR-rs2 след DSS лечение в сравнение с WT животни.

AnxA1 (-/-) мишки показват намалена експресия на ALX/FPRL-1 след DSS лечение. Обща РНК се екстрахира от лигавични тъкани от контролни и DSS-третирани мишки WT и AnxA1 (-/-) и се подлага на RT-PCR анализ за ALX/FPRL-1, FPR-rs2 и FPR1. Въпреки че нивата на ALX/FPRL-1 бяха потиснати при животни от типа WT, третирани с DSS, по-нататъшно намаляване на ALX/FPRL-1 иРНК се наблюдава при AnxA1 (-/-) животни след DSS лечение (A; n = 3 животни). Експресията на FPR-rs2 не се променя след прилагане на DSS при WT животни, но е драматично намалена при мишки AnxA1 (-/-) след 7 курс на DSS лечение (B; n = 3 животни). Подобно намаляване на експресията на FPR1 се наблюдава след DSS лечение при WT и AnxA1 (-/-) животни (C; n = 3 животни).

Дискусия

Доказано е, че AnxA1 играе защитна или противовъзпалителна роля в различни модели на заболяване (13, 14, 15, 17, 47). Въпреки това, сравнително малко се знае за ролята на AnxA1 за регулиране на наранявания и възпаления в стомашно-чревния тракт. Последните проучвания идентифицират ролята на AnxA1 за медиирането на гастропротективните ефекти на дексаметазон срещу нестероидно противовъзпалително лекарствено увреждане, както и за насърчаване на възстановяването на стомашни язви (21, 48). В долната част на стомашно-чревния тракт, проучвания, използващи модели на колит на гризачи, както и анализ на човешки улцерозен колит са установили повишена експресия и секреция на този противовъзпалителен медиатор (26, 27). Настоящото проучване беше проведено, за да се изследва функционалното значение на експресията на AnxA1 по време на остро увреждане и възпаление на дебелото черво, както и при възстановяване на лигавичните тъкани.

AnxA1 е функционално разнообразен противовъзпалителен протеин, който се експресира от различни видове клетки, включително епителни клетки (49, 50, 51, 52, 53, 54, 55). Идентифицирахме експресията на AnxA1 в нормални миши клетки на епител на дебелото черво по оста на криптата. Установено е, че AnxA1 се локализира в цитоплазмения компартмент на крипталния епител. Интересното е, че AnxA1 е открит в изобилие покрай апикалните и страничните домени на плазмената мембрана в повърхностните ентероцити в допълнение към цитоплазмата. Разликата в локализацията между епителните клетки на криптата и напълно диференцираните повърхностни ентероцити може да предполага, че AnxA1 играе роля в регулирането на диференциацията и/или узряването на епителните клетки на дебелото черво. Такава роля за AnxA1 се наблюдава при in vitro проучвания, използващи моделни епителни клетъчни линии (53, 56). Не наблюдавахме никакви морфологични или явни функционални разлики в лигавицата на дебелото черво на WT и AnxA1 (-/-) животни. По този начин хомеостатичната роля на AnxA1 в миши чревен епител остава неизвестна и излишните системи могат да компенсират неговия дефицит. Алтернативно, защитната му функция може да започне да действа след прилагане на обида.

В съответствие с предишни проучвания, идентифициращи повишена експресия на AnxA1 в индуциран от тринитробензенсулфонова киселина колит при плъхове (26), ние наблюдавахме значително регулиране на експресията на AnxA1 в лигавиците на лигавиците и по-точно в епитела на дебелото черво след прилагането на DSS. Освен това, AnxA1-дефицитни животни показват значително повишена чувствителност към DSS-индуцирано увреждане на дебелото черво и заболеваемост. Тези открития предполагат защитна роля за AnxA1 при остро увреждане на дебелото черво.

В допълнение към повишената чувствителност към DSS-индуциран колит, AnxA1 (-/-) животни демонстрират нарушено клинично и хистопатологично възстановяване след прекратяване на лечението с DSS. Това откритие предполага, че AnxA1 играе важна роля за насърчаване на зарастването на рани на лигавицата на дебелото черво. Предишни in vitro проучвания от нашата група идентифицираха ролята на AnxA1 в стимулирането на ALX/FPRL-1-медиирано усилване на миграцията на епителните клетки чрез триизмерни матрици (20). Тъй като е необходима миграция на епителни клетки за заздравяване на рани на лигавиците и регенерация, медиирано от AnxA1 активиране на ALX/FPRL-1 може да бъде важен механизъм за насърчаване на заздравяването на рани на лигавиците на червата. В съответствие с тази идея, проучванията идентифицират ролята на медиирана от AnxA1 стимулация на ALX/FPRL-1 за насърчаване на зарастването на индуцирани от индометацин язви на стомаха (21). В този доклад обаче животните с дефицит на AnxA1 не проявяват повишена чувствителност към индуциране на образуване на язва в стомаха, както наблюдавахме за DSS-индуцирано нараняване.

В обобщение, демонстрирахме, че AnxA1 се експресира от миши чревни епителни клетки и експресията му се увеличава след прилагане на DSS. Мишките, които нямат AnxA1, показват повишена чувствителност към DSS-индуцирано увреждане на лигавицата, което води до увеличаване на свързаната заболеваемост. Мишките с дефицит на AnxA1 също показват нарушено клинично и хистопатологично възстановяване след прилагане на DSS. Освен това, стимулирането на ALX/FPRL-1 при AnxA1 (-/-) животни намалява тежестта на заболяването, индуцирано от DSS, до това на WT животни, но не подобрява значително тежестта на заболяването при WT животни. И накрая, AnxA1 (-/-) мишки показват намалени нива на миши липоксинови рецептори след DSS лечение в сравнение с WT животни. Взети заедно, тези данни подкрепят защитната роля на AnxA1 след остро увреждане на чревната лигавица, където също улеснява възстановяването на епителната бариера. Нашите данни също така включват роля за активирането на ALX/FPRL-1 при медиирането на защитните ефекти на AnxA1 срещу увреждане на чревната лигавица. Вникването в механизмите, чрез които AnxA1 предпазва от чревни наранявания и насърчава възстановяването на лигавицата, може да допринесе за разработването на терапии за предотвратяване на увреждане на чревната лигавица и подобряване на заздравяването.

Благодарности

Благодарим на д-р Е. Родригес-Булан за подаръка на клетки SKCO-15 и д-р С. Вос за съдействието на клетъчната култура.