• Разделен екран
  • Икона за споделяне Дял
    • Facebook
    • Twitter
    • LinkedIn
    • електронна поща
  • Икона на инструменти Инструменти

    • Анна Щербина, Айлин Ремолд-О’Донъл; Роля на каспазата в подгрупа от отговори за активиране на човешки тромбоцити. Кръв 1999; 93 (12): 4222–4231. doi: https://doi.org/10.1182/blood.V93.12.4222

      каспазата

      Изтеглете файла с цитат:

      Резюме

      PLATELETS СА ОСНОВНИТЕ играчи на хемостаза и тромбоза. Наред с други отговори на физиологични агонисти, активираните тромбоцити излагат отрицателно заредения фосфотидилсерин (PS) върху външната страна на тромбоцитите и освобождават PS-положителни микрочастици, които и двете допринасят за отлагането на фибрин, като осигуряват компетентни повърхности за сглобяване на факторите на коагулация и образуване на тромби на циркулиращите микрочастици са свързани с различни тромботични нарушения, включително активирана коагулация, преходна исхемия, инфаркт на миокарда и след операция при пациенти с кардиопулмонален байпас.2-6 Поради тези причини проучванията за очертаване на механизмите на експозиция на PS и освобождаване на микрочастици са изключително важни за разбирането функция на тромбоцитите.

      Излагането на PS и освобождаването на микрочастици се случват само в рамките на по-големия процес на тромбоцитно активиране. Обратно, реакцията на активиране на тромбоцитите се отличава с множество подсъбития и регулаторни механизми. Особено забележително е последователният характер на отговора и временното подреждане на отделните стъпки. Няколко паралела могат да бъдат разпознати между програмираната реакция на активиране на тромбоцитите и програмираната смърт на ядрените клетки - апоптотичният процес. Общите характеристики включват забележимостта на координирани морфологични промени и до голяма степен качеството на необратимостта. При активирането на тромбоцитите, както и при апоптозата, трансбилайерната миграция на фосфатидилсерин към листчето на външната мембрана е важно събитие, улесняващо взаимодействието с фагоцитни клетки и, в случай на тромбоцити, генериращо, в допълнение, прокоагулантната повърхност. Също така, процесът на образуване на микрочастици на тромбоцити е морфологично подобен на мембранната фаза на смесване на ядрена клетъчна апоптоза. Тези общи характеристики ни подтикнаха да разгледаме възможната роля в активирането на тромбоцитите за каспази, семейство протеаза, тясно свързано с програмирана смърт на ядрени клетки.

      Каспазите, които са цистеинилови протеази, които се разцепват след аспарагинова киселина, са ключови фактори за апоптоза. Семейството се състои от най-малко 11 ензима при хора.7-9 В отговор на апоптотични сигнали, проформата на инициатор каспаза, съдържаща адаптер домен, като каспаза-8, -9 или -10, се набира в повърхностна мембрана комплекс или получен от митохондрии комплекс, където се обработва автопротеолитично до двете активни форми на субединицата. Първоначално активираната каспаза обработва/активира други прокаспази, при които липсват адаптерни домейни, включително каспаза-3 и -7, а последните, ефекторните каспази, обезсилват основните хомеостатични пътища чрез ограничено разцепване на специфични цели.

      Друг отличителен белег на ядрено-клетъчната апоптоза е разцепването на избрани цитоскелетни протеини чрез ефекторни каспази.10,11 В това проучване се фокусираме върху един цитоскелетен протеин, мизин, единственият член в човешките тромбоцити12,13 от семейството на ERM (езрин-радиксин-миезин) протеини, които стабилизират повърхностните проекции чрез свързване на подлежащия актинов цитоскелет с плазмената мембрана. 16а реакция, която се очаква да прекрати линкерната функция на мизин и да улесни късните цитоскелетни промени на тромбоцитите, необходими за ретракция на съсирек и освобождаване на микрочастици. Разцепването на мизин изисква калпаин (Ca 2+-активирана протеаза), който е необходим и за освобождаване на микрочастици17,18; обаче чистият калпаин сам не разцепва мизин 13, което предполага изискване за втора протеаза.

      Настоящият доклад разкрива нови основи, като демонстрира присъствието и новата функция на каспазата в човешките тромбоцити. Ние идентифицираме зимогенната форма на ефекторната каспаза, каспаза-3, като компонент на човешките тромбоцити и демонстрираме, че прокаспаза-3 се активира, когато изолирани тромбоцити се стимулират от физиологични агонисти. Показано е, че специфичен клетъчно-проникващ инхибитор на каспаза-3 отменя индуцираната от агонист експозиция на PS и освобождаване на микрочастици. Инхибиторът на каспаза също така предотвратява разцепването на структурния протеин миезин в активирани тромбоцити. Сравнителните експерименти с протеазни инхибитори показват, че както каспазата, така и калпаинът функционират при индуцирани от агониста късни събития на активиране на тромбоцитите (експозиция на PS, освобождаване на микрочастици и разцепване на мизин) и показват, че двете протеази имат различни роли.

      МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

      Изолация на тромбоцитите.

      Прясно взетата кръв от нормални здрави донори, които са дали писмено съгласие, се събира в киселина-цитрат-декстроза (ACD; NIH формула А) в пластмаса и се фракционира незабавно при стайна температура. Клетките се преброяват с помощта на MAX-M анализатор на кръвни клетки (Coulter Corp, Hialeah, FL). Кръвта се центрофугира при 200 g за 12 минути, за да се отдели богата на тромбоцити плазма (PRP). Добавя се допълнителен ACD (1 част ACD на 3 части PRP) и тромбоцитите се пелетират при 800 g за 15 минути. Тромбоцитите бяха ресуспендирани в тромбоцитен буфер (10 mmol/L трис-хидроксиметил-метил-2-аминоетансулфонова киселина [TES], рН 7.2, 136 mmol/L NaCl, 2.6 mmol/L KCl, 0.5 mmol/L NaH2PO4, 2 mmol/L MgCl2, 0,1% глюкоза и 0,1% говежди албумин) и след добавяне на ACD (20% от крайния обем) и простациклин (1 μg/ml; Calbiochem, Сан Диего, Калифорния), се центрофугират при 800 g за 10 минути. Изолираните тромбоцити не съдържат откриваеми еритроцити и по-малко от 1 левкоцит на 4000 тромбоцити. За експерименти с активиране, тромбоцитите се суспендират в тромбоцитен буфер и се оставят да се възстановят за 90 минути при 37 ° C, за да се осигури тяхното състояние на покой.

      Анализ на пептидаза.

      Тромбоцитите (5 × 10 8) в 1 ml тромбоцитен буфер с 2 mmol/L CaCl2 и 3 μmol/L A23187 се инкубират при разбъркване в плоски полиетиленови флакони (диаметър 14 mm) при 37 ° C за посоченото време и се лизират чрез добавяне на 1/3 об. 4% Triton X-100, 8 mmol/L EGTA, 20 mmol/L дитиотреитол, 200 μg/ml апротинин, 200 μg/ml бензамидин и 200 μg/ml левпептин. Лизоните Triton (200 μL) се комбинират с 0,1 mmol/L N-ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-p-нитро анилид (DEVD-pNA; Enzyme Systems Products, Livermore, CA) или N-ацетил-Tyr -Val-Ala-Asp-p-нитроанилид (YVAD-pNA; Sigma, Сейнт Луис, МО). Реакциите бяха инкубирани в продължение на 2 часа в плоско дъно с 96 ямки при 37 ° С с проследяване на OD405 nm. Средното ΔOD на минута се изчислява от линейния диапазон на реакцията.

      Имуноблотинг.
      Активиране на тромбоцитна каспаза.

      Тромбоцитите (5 × 10 8) в 1 ml тромбоцитен буфер с 2 mmol/L CaCl2 в флакони с плоско дъно от полиетилен се инкубират при разбъркване с 3 μmol/L A23187, 1 U/ml човешки тромбин, 10 μg/ml колаген (естествени колагенови фибрили от еднокопитни сухожилия; Колагенов реактивен рог; Nycomed Arzneimittel GmbH, Мюнхен, Германия), или комбинацията от тромбин и колаген при 37 ° C за 20 минути с разбъркване. Реакцията се прекратява чрез разтваряне със SDS при подготовка за имуноблотинг.

      Лечение с каспаза и инхибитори на калпаин.

      За експерименти с инхибиране карбобензокси-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -флуорометилкетон (DEVD-fmk), карбобензокси-Tyr-Val-Ala-Asp (OMe) -флуорометил кетон (YVAD-fmk), карбобензокси-Phe-Ala-флуорометилкетон (FA-fmk) или разредител се добавя към тромбоцитите през последните 60 минути от преинкубацията и калпептин и E64d се добавят през последните 10 минути. За експерименти с разцепване на мизин се приготвят запаси от флуорометилкетон в диметилсулфоксид, препоръчителният разтворител или диметилформамид. За експериментите с експозиция на PS установихме, че предварителната инкубация на тромбоцитите с диметилсулфоксид (0,01% до 1,0%), но не и с диметилформамид, значително увеличава индуцираната от A23187 експозиция на PS (данните не са показани). Следователно, запасите от флуорометилкетон за експозиция на PS и всички други експерименти бяха приготвени в диметилформамид (0,2% крайна концентрация). Използвайки този разредител, инкубирането на тромбоцитите с флуорометилкетони в продължение на 1 час не променя стойностите на тромбоцитите в покой в ​​нито един от изследваните параметри. Запасите от калпептин и E64d се приготвят в етанол или диметилформамид.

      Активиране на тромбоцитите и поточна цитометрия.

      За експерименти с експозиция на PS и освобождаване на микрочастици, 10 7 тромбоцита в 200 μL тромбоцитен буфер с 2 mmol/L CaCl2 бяха поставени в силиконизирани 7 × 45 mm стъклени кювети при 37 ° C в агрегатен метър (DP-247E; Sienco, Morrison, CO) . A23187 (1 μmol/L), тромбин (човек; 1 U/mL; Sigma) или тромбин (1 U/mL) плюс колаген (20 μg/mL) се добавя от разреден изход и след първоначално смесване, инкубация продължи без разбъркване при 37 ° С в продължение на 1 до 20 минути. Суспензиите на тромбоцитите се прехвърлят във водна баня с приблизително 22 ° C и след 1 минута 50 μL се комбинират с белязан с флуоресцеин изотиоцианат анексин V (анексин V-FITC; 1 μg/ml; PharMingen, Сан Диего, Калифорния) и фикоеритрин (PE) -белязан анти-CD41 (GPIIb) MoAb (150 ng/mL; Coulter/Immunotech, Miami, FL) и се инкубира в продължение на 10 минути при приблизително 22 ° C. Пробите се разреждат петкратно с тромбоцитен буфер с 2 mmol/L CaCl2 за незабавен анализ чрез поточна цитометрия.

      Пробите бяха получени и анализирани с помощта на проточен цитометър FACS-Calibur и софтуер CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Частиците бяха затворени за CD41 +, за да се разграничат тромбоцитите и получените от тромбоцитите микрочастици от електронния шум. Долната граница на тромбоцитната порта е дефинирана върху профила на разпръскване на тромбоцитите в покой и CD41 + частици, по-малки от тези, които се считат за микрочастици.

      За измерване на секрецията на а-гранули, 10 7 тромбоцита се активират, както е описано по-горе, и реакцията се спира след 0, 30 или 60 секунди чрез добавяне на равен обем от 2% параформалдехид. Аликвотни части от фиксираните тромбоцити се инкубират в продължение на 10 минути с 1 μg/mL белязан с PE анти-CD62P (клон AC1.2 MoAb; Becton Dickinson, Сан Хосе, Калифорния) и се изследват чрез поточна цитометрия.

      За да се измери агрегацията в отговор на тромбин или A23187, 10 7 тромбоцити се инкубират, както е описано по-горе, с разбъркване и пропускането на светлина се измерва като функция от времето според инструкциите на производителя.

      Анализ за разграждане на мизин.

      След предварителна инкубация на 5 × 10 8 тромбоцити в 1 ml тромбоцитен буфер във флакони с плоско дъно от полиетилен, се добавят CaCl2 (2 mmol/L) и A23187 (3 μmol/L) и инкубацията продължава 10 или 20 минути при 37 ° C с разбъркване. Реакцията се прекратява чрез разтваряне със SDS.

      Статистически анализ.

      Сдвоеният t-тест на Student е използван за изчисляване на Pvalues.