Субекти

Резюме

Въведение

Деменцията, свързана с възрастта заболяване, се характеризира с трудности с паметта, говоренето, решаването на проблеми и други когнитивни способности 1. Има много видове деменция, включително болестта на Алцхаймер (AD), деменция на тялото на Lewy, смесена деменция и съдова деменция 1,2. Тъй като продължителността на живота се увеличава, броят на пациентите с деменция продължава да се увеличава, но използваните в момента лекарства за инхибиране на ацетилхолин естераза само забавят симптоматичната прогресия и няма лечебно лечение 3. Други терапевтични средства срещу амилоид-бета или фосфо-тау са разработени като целеви лекарства; клиничните изпитвания обаче не са били успешни 4. Следователно е необходимо да се разработят терапевтични лекарства с нова посока.

Азоловите лекарства обикновено се използват като противогъбични средства и основното им действие е да инхибират синтеза на гъбични клетъчни мембрани 17. Интересното е, че тези лекарства инхибират експресията на iNOS 18,19. Има съобщения, показващи, че невропротективните ефекти на MCZ, като ремиелинизация 20, предпазват кръвоносните съдове от разкъсване и възпаление при хеморагичен инсулт 21 и е показано, че MCZ преминават през кръвно-мозъчната бариера след интраперитонеално приложение при мишки 22. Липополизахаридите (LPS) са молекули, които обикновено се използват за индуциране на iNOS сигнализиране; Следователно излагането на LPS може да увеличи експресията на iNOS и невровъзпалението в невроналните клетки 23,24,25. По този начин, проучване върху животни, интраперитонеално инжектиране на LPS е използвано за индуциране на модел на когнитивно увреждане при мишки 26,27,28,29 .

За да изследваме дали азоловите лекарства могат да бъдат полезни за AD чрез инхибиране на експресията на iNOS и последващото невровъзпаление, ние прилагаме MCZ, азолно лекарство, и оценяваме анти-AD ефекта и неговия активен механизъм въз основа на биоинформатичен анализ (Допълнителна фигура 1).

Материали и методи

Експерименти с животни

Общо 40 възрастни 8-седмични мъжки мишки C57BL6/N (20–25 g) са закупени от Daehan Biolink (Chungcheongbuk-do, Корея) и са били поддържани в съответствие с насоките на Националния институт по токсикологични изследвания и Корейска администрация по храните и лекарствата за хуманна грижа и използване на лабораторни животни. Всички експериментални процедури в настоящото проучване са одобрени от IACUC на Националния университет Chungbuk (номер на одобрение: CBNUA-1088-18-01). Животните бяха настанени в стая, която автоматично се поддържаше на 21-25 ° C, с относителна влажност 45-65% и контролиран 12-часов цикъл светлина-тъмнина. За да предизвикат увреждане на паметта, мишките бяха разпределени на случаен принцип в четири групи. Група 1 (контролна група; н = 8) получи физиологичен разтвор и група 2 (MCZ група; н = 8) получи MCZ (40 mg/kg), група 3 (LPS група; н = 12) получи LPS (250 μg/kg/ден), група 4 (MCZ + LPS група; н = 12) получи и двете. Всички инжекции са направени в продължение на 7 дни с интраперитонеално приложение. Концентрацията на лекарството и начинът на приложение са посочени в други изследователски статии, които показват концентрацията на MCZ в мозъка от i.p. инжекция 22,26 .

Материали

Миконазол, флуконазол и клотримазол Фармакопея на САЩ (USP) Референтен стандарт и липополизахариди от Escherichia coli O111: B4 и други химикали са получени от Sigma-Aldrich (САЩ).

Воден лабиринт на Морис

Тестът за воден лабиринт на Morris е широко приет метод за изследване на когнитивните функции и е използван в настоящото проучване, както е описано по-рано 30. Накратко, кръгъл пластмасов басейн (височина 35 см, диаметър 100 см) беше напълнен с вода (плюс бяла боя), поддържана при 22-25 ° C. Евакуационна платформа (височина 14,5 см, диаметър 4,5 см) беше потопена на 1–1,5 см под повърхността на водата. Тестът се провежда три пъти на ден в продължение на 5 дни по време на фазата на придобиване (дни 1–5), с три рандомизирани начални точки. Положението на евакуационната платформа се поддържаше постоянно. Всяко изпитание продължи 60 s или завършва веднага щом мишките достигнат потопената платформа. Моделът на плуване на всяка мишка се наблюдава и записва от камера, монтирана над центъра на басейна, а латентността на бягството, разстоянието за бягство и скоростта на плуване се оценяват от програмата SMART-LD (Panlab, Испания). Тиха среда, постоянна температура на водата се поддържа през целия експериментален период.

Тест на сонда

За да се оцени консолидацията на паметта, беше направен тест на сондата 24 часа след теста с воден лабиринт (т.е. ден 6). За теста на сондата платформата беше извадена от басейна и мишките можеха да плуват свободно. Моделът на плуване на всяка мишка се наблюдава и записва в продължение на 60 s с помощта на програмата SMART-LD (Panlab). Консолидираната пространствена памет се изчислява от времето, прекарано в целевата площ на квадранта.

Тест за ефективност на пасивното избягване

Отговорът за пасивно избягване се определя с помощта на апарат „стъпка през“ (Med Associates, САЩ), който е разделен на осветено отделение и тъмно отделение (всяко 20,3 × 15,9 × 21,3 cm), прилежащо едно към друго през малка порта с решетка под, 3.175 мм пръти от неръждаема стомана, разположени на разстояние 8 мм. Двадесет и четири след теста на сондата (т.е. ден 7) 3 минути привикване в отворената камера без шок. Четиридесет и осем часа след теста на сондата (т.е. Ден 8) беше проведено тренировъчно изпитание. Мишките бяха поставени в осветеното отделение с лице към тъмното отделение за тренировъчния опит. Когато мишките се преместиха изцяло в тъмното отделение, те получиха токов удар (0,4 mA, продължителност 3 s). След това мишките бяха върнати в клетката си. Двадесет и четири часа след тренировъчното изпитание (т.е. ден 9), всяка мишка се поставя в осветеното отделение и се измерва латентният период за влизане в тъмното отделение, определен като „задържане“. Времето, когато мишките влязоха в тъмното отделение, беше записано и описано като стъпка през латентност. Опитите за задържане бяха определени на ограничение на времето от 180 s.

Събиране и съхранение на мозъка

След поведенчески тестове мишките бяха перфузирани с буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS, рН 7,4) с хепарин при инхалационна СО2 анестезия. Мозъците веднага бяха извадени от черепите и разделени на ляв и десен мозък. Единият се съхранява при -80 ° C, другият се фиксира в 4% параформалдехид за 72 h при 4 ° C и се прехвърля в 30% разтвори на захароза.

Тест на открито

Локомоторната активност е тествана на 61 × 61 cm открито поле (н = 6 на група). Мишките бяха поставени независимо в единия ъгъл на арената и хоризонталните движения бяха записани в продължение на 30 минути с програмата за проследяване на видеоклипове Any-Maze Behavior SMART-LD (Panlab). Камерата на открито се почиства между опитите със 70% обем/обем алкохолен разтвор.

Aβ1–42-индуциран експеримент с животни

Осем до 10 седмици мъжки мишки C57BL6/N (Daehan Biolink, Chungcheongbuk-do, Република Корея) се поддържат и обработват в съответствие с насоките за хуманна грижа и употреба на животните от корейската FDA. Моделът на инфузионна мишка е адаптиран от предишната работа върху инфузионния модел на плъхове. За да се предизвика увреждане на паметта, мишките бяха разпределени на случаен принцип в три групи. Група 1 (контролна група; н = 10) получи физиологичен разтвор 7 дни след операцията и група 2 (Aβ инфузия; н = 10) получи физиологичен разтвор 7 дни след операцията, група 3 (Aβ инфузия; н = 10) получи MCZ (40 mg/kg/ден) 7 дни след операцията. Анестезираните животни бяха поставени в стереотаксичен инструмент и катетрите бяха прикрепени към осмотична мини-помпа (Alzet 1002, ALZA, Mountain View, CA, USA) и комплект за мозъчна инфузия 1 (Alzet комплект 3-5 mm, ALZA), който са имплантирани съгласно следните координати: мишка (едностранно): -1,0 mm отпред/отзад, +0,5 mm медиално/странично и -2,5 mm дорзално/вентрално. Съдържанието на помпата се освобождава за период от 14 дни, състоящ се от 300 pmol агрегиран Ар1-42 (Bachem Chemical, Torrance, CA, USA), разтворен в стерилен физиологичен разтвор (0.9% NaCl) за всяка помпа. След това тестовете за поведение на способността за учене и памет бяха оценени с помощта на три теста (воден лабиринт, сонда и тестове за пасивно избягване).

Астроцити и микроглиална BV2 клетъчна култура

Имунохистохимично оцветяване

След прехвърляне в 30% разтвори на захароза, мозъците се вграждат в парафин, рутинно се обработват и след това се разделят на 10 μm дебели резени с помощта на въртящ се микротом (Leica RM 2125 RTS, Сингапур). Секциите бяха бионилирани с GFAP (Santa cruz, # sc-33673), Iba-1 (Wako, # 019-19741), iNOS (Thermo, # PA3-030A), COX-2 (abcam, # ab52237) антитяло (1: 100) инкубация през нощта при 4 ° C и вторични антитела срещу IgG-хрян пероксидаза (HRP) (1: 500; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта Круз, Калифорния, САЩ), 1 час 30 минути инкубация при стайна температура . Мозъчни секции, визуализирани чрез хромогенна DAB (Vector Laboratories) реакция за до 10 минути и оцветени с хематоксилин за 30 s. Накрая мозъчните секции бяха дехидратирани в етанол, изчистени в ксилол, монтирани с Permount (Fisher Scientific, Hampton, NH) и оценени с помощта на светлинна микроскопия (Microscope Axio Imager. A2, Carl Zeiss, Oberkochen, Германия) (× 50 и × 200).

Уестърн блотинг

РНК изолация и количествена верижна реакция на обратна транскриптаза полимераза в реално време (RT-PCR)

Тъканната РНК беше изолирана от хомогенизиран хипокампус с помощта на RiboEX (Gene All, Сеул, Корея), а общата РНК (0.2 μg) беше обратно транскрибирана в допълнителна ДНК (cDNA) съгласно инструкциите на производителя, използвайки Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) . За количествените анализи в реално време с обратна транскриптазна полимеразна реакция (PCR) линейността на амплификациите на iNOS, фактор на туморна некроза (TNF) -α, интерлевкин (IL) -1β, IL-6 и GAPDH кДНК е установени в предварителни експерименти. Всички сигнални иРНК се нормализират до GAPDH иРНК. кДНК се амплифицират чрез PCR в реално време в два екземпляра с QuantiNova SYBR зелен PCR комплект (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). Всяка проба се изпълнява със следните набори праймери: miNOS, 5'-TGACGCTCGGAACTGTAGCAC-3ʹ (смисъл), 5ʹ-TGATGGCCGACCTGATGTT-3ʹ (антисенс); mTNF-α, 5’-TGTAGCCCACGTCGTAGCAA-3’ (смисъл), 5ʹ-AGGTACAACCCATCGGCTGG-3ʹ (антисенс); mIL-1β, 5’-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3’ (смисъл), 5ʹ-ATGTGCTGCTGCGAGATTTG-3ʹ (антисенс); mIL-6, 5’-CCACTTCACAAGTCGGAGGC-3’ (смисъл), 5ʹ-GCCATTGCACAACTCTTTTCTCA-3ʹ (антисенс); mGAPDH: 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’ (смисъл), 5ʹ-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3ʹ (антисенс).

Анализ на цитокини

Нивата на тъканите на мишки TNF-α, IL-6 и IL-1β се измерват чрез комплекти за имуносорбентен анализ (ELISA), предоставени от R&D системи (Минеаполис, MN, САЩ), съгласно протокола на производителя.

Нитритен анализ

Астроцитите и микроглиалните BV2 клетки се посяват с плътност 3 × 105 клетки/гнездо в 6-гнездни плаки на 2 ml среда за 24 часа. След отстраняване на хранителната среда, клетките след това се третират с LPS (1 μg/mL) и миконазол (1.25, 2.5, 5, 10 μM) на 2 mL среда за 24 часа. Нитритът в супернатанта беше оценен с помощта на комплект за откриване на NO (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Корея), съгласно инструкциите на производителя. И накрая, полученият цвят беше изследван при 520 nm с помощта на четец за абсорбция на микроплаки (VersaMax ELISA, Molecular Devices, Калифорния, САЩ).

Анализ на активността на плазмиден вектор и луцифераза

BV2 клетките се посяват в плаки с 12 ямки (1 × 105 клетки/ямка) и се прехвърлят временно с pNF-κB-Luc плазмид, за да се оцени NF-kB активността (5x NF-kB; Stratagene, La Jolla, CA ), iNOS промотор с двоен репортер (MPRM38938-LVPG04) и отрицателен контрол (NEG-LVPG04) вектори на лентивирусни плазмиди, закупени от GeneCopoeia (Rockville, MD, САЩ), като се използва смес от плазмид (20 nM) и реагент Lipofectamine 3000 в OPTI -MEM, според спецификацията на производителя (Invitrogen). Трансфектираните клетки се третират с LPS (1 μg/mL) и различни концентрации (1.25, 2.5, 5, 10 μM/mL) миконазол в продължение на 12 часа. Активността на луциферазата се измерва с помощта на комплекта за анализ на двойна луминисценция Secrete-Pair ™ (Genecopoeia, Rockville, MD, САЩ) и отчитане на резултатите на луминометър, както е описано в спецификациите на производителя (WinGlow, Bad Wildbad, Германия).

Издърпващ анализ

BV2 клетъчният лизат беше конюгиран с епокси-активирана сефароза 6В (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО). iNOS (1 mg) се разтваря в 1 ml свързващ буфер (35% DMSO и 0,5 М NaCl, рН 8,3). Активираната с епокси сефароза 6В се набъбва и се промива в 1 mM НС1 през филтър от синтеровано стъкло, след което се промива с свързващ буфер. Епокси-активирани сефарозни 6В зърна се добавят към MCZ-съдържащия свързващ буфер и се инкубират при 4 ° С за 24 часа. Конюгираната с iNOS сефароза 6В се промива с три цикъла от променливи рН промивни буфери (буфер 1, 0,1 М ацетат и 0,5 М NaCl, рН 4,0; буфер 2, 0,1 М Трис-НС1 и 0,5 М NaCl, рН 8,0). След това iNOS-конюгирани зърна бяха уравновесени със свързващ буфер (0.05 М Tris-HCI и 0.15 М NaCl, рН 7.5). Контролните неконюгирани епокси-активирани сефарозни 6В зърна се приготвят, както е описано по-горе в отсъствието на iNOS. Клетъчният лизат се смесва с iNOS-конюгирана сефароза 6В или сефароза 6В при 4 ° С за 24 часа. След това зърната се измиват три пъти с буфериран с Tris физиологичен разтвор и Tween 20 (TBST). Свързаните протеини се елуират със SDS буфер за зареждане. След това протеините бяха разделени чрез SDS-PAGE, последвано от имуноблотинг с антитела срещу iNOS (1: 1000, Novus Biologicals, Inc., Littleton).

Процедура на докинг

Проучванията за докинг между MCZ и iNOS бяха извършени с помощта на Autodock VINA. Триизмерни структури на свързаните с iNOS-7-нитродазол комплекси бяха извлечени от Протеиновата банка данни [PDB: 1M8E], а триизмерната структура на iNOS беше изградена с помощта на Chem3D и ChemDraw, която беше допълнително подготвена с помощта на AutodockTools. Решетъчната кутия беше центрирана върху iNOS мономера и размерът на мрежовата кутия беше коригиран така, че да включва целия мономер. Молекулярната графика за най-добрия модел на подвързване е генерирана с помощта на визуализатора на Discovery Studio.

Флуоресцентна микроскопия

Фиксираните клетки бяха изложени на следните първични антитела: р65 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта Круз, Калифорния, САЩ), при стайна температура в продължение на 2 часа. След инкубация, клетките се промиват два пъти с ледено студен PBS и се инкубират с антимиши вторични антитела, конюгирани с Alexa Fluor 568 nm (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA) при стайна температура за 1 h. Имунофлуоресцентни изображения са получени с помощта на K1-Fluo лазерно сканиращ конфокален микроскоп (Nanoscope Systems, Daejeon, Корея).

Анализ на жизнеспособността на клетките

Всяка клетъчна линия (микроглиален BV2 и култивирани астроцити 1 × 104 клетки) се култивира в продължение на 24 часа и след това се обработва с LPS (1 μg/mL) и/или миконазол (1.25, 2.5, 5, 10, 20 μM) в продължение на 24 часа з. След инкубация в продължение на 24 часа при 37 ° С, МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид; Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ) се добавя, разреден в DMEM среда, се добавя. към всяка ямка и се извършва инкубация в продължение на 90 минути. След това супернатантата се изхвърля и кристалните продукти се елуират с DMSO (200 μL/ямка; Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ). Колориметричната оценка беше извършена със спектрофотометър при 540 nm за откриване на клетъчния растеж.

Биоинформатика

Използвайте платформата с отворен код Open Targets (www.targetvalidation.org) и Disease-connect (disease-connect.org).

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на GraphPad Prism v5.0. Всички данни бяха изследвани за нормално разпределение с тест за нормалност на D’Agostino & Pearson. Ако набор от данни показва нормално разпределение, несдвоен двустранен студент т-тест или двупосочен ANOVA за повтарящи се мерки и е използван post-hoc анализ на Bonferroni. Ако наборът от данни не показва нормално разпределение, двустранен Ман – Уитни U-е използван тест. За да се осигури правилен модел на животни, първоначалният опит (метод на таблица с произволни числа) е възложен на всяка група според предишния опит (като се има предвид смъртността на мишки и успешното създаване на модел). Данните не включват хора, така че не използвахме щори за този експеримент. Данните са представени като средната стойност ± S.E.M. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра.

Резултати

Миконазол подобрява увреждането на паметта при мишки, лекувани с LPS

противогъбично

Миконазол намалява невровъзпалението в мозъка на лекувани с LPS мишки

Прекомерното невровъзпаление засяга загубата на памет чрез активиране на астроцитите и клетките на микроглията. Поради това извършихме имунохистохимия (IHC) и уестърн блотинг, за да открием активирането на глиални клетки от GFAP (маркер на астроцитите), Iba-1 (маркер на микроглията) и възпалителните протеини iNOS и COX-2 в мозъка. Третираните с MCZ мишки показват по-малко GFAP-реактивни и Iba-1-реактивни клетки в мозъка, отколкото LPS-инжектирани мишки (Фиг. 2а, b и Допълнителна Фиг. 4A, B за пълен анализ). Реактивните клетки за възпалителните протеини (iNOS и COX-2) също са по-ниски в мозъците, третирани с MCZ + LPS, в сравнение с мозъците, третирани с LPS + физиологичен разтвор (фиг. 2в, d и допълнителна фиг. 5А, В за пълен анализ) ). Уестърн блотинг също показва, че лечението с MCZ намалява експресията на GFAP, Iba-1 и COX-2 в хипокампусната тъкан на мишки, лекувани с LPS (фиг. 3а). Установихме, че лечението с MCZ намалява нивата на иРНК на TNF-α (фиг. 3b), IL-1β (фиг. 3c) и IL-6 (фиг. 3d) в тъканите на мозъчния хипокампус. Освен това извършваме ELISA, че лечението с MCZ значително намалява нивата на протеини на TNF-α (фиг. 3д), IL-1β (фиг. 3е) и IL-6 (фиг. 3ж) в мозъчните хипокампусни тъкани.