Етнофармакология

Тази статия е част от изследователската тема

Фитохимикали за предотвратяване и управление на метаболитен синдром Вижте всички 54 статии

Редактиран от
Джианбо Сяо

Университет в Макао, Китай

Прегледан от
Раджендра Карки

Детска изследователска болница Сейнт Джуд, САЩ

Yonghui Zhang

Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Китай

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

антидиабетни

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Колеж по основна медицина, Университет по китайска медицина Хубей, Ухан, Китай
  • 2 Център за изследване на сърбеж, Катедра по анестезиология, Медицинско училище във Вашингтонския университет, Сейнт Луис, Мисури, САЩ
  • 3 Barnes-еврейска болница, Сейнт Луис, Мисури, САЩ
  • 4 Колеж по фармацевтични науки, Южен централен университет за националности, Ухан, Китай

Въведение

Захарният диабет (ЗД) е добре позната група метаболитни нарушения, характеризиращи се с хипергликемия в резултат на абнормна секреция и/или действие на инсулин (Rochester and Akiyode, 2014). DM засяга милиони хора по света, с бързо нарастваща честота и разпространение. Според статистиката на Международната федерация по диабет през 2013 г. 382 милиона души по света имат диабет, повече от 90% от тях имат диабет тип 2 (T2DM) и дори този брой ще се увеличи до 592 милиона до 2035 г. (Rochester and Akiyode, 2014; Saisho, 2015). Инсулиновата резистентност (IR) възниква, когато инсулиночувствителните тъкани (главно скелетни мускули, мастна тъкан и черен дроб) губят способността си да реагират правилно на инсулин (Hirabara et al., 2012), което се приема като основна патофизиологична характеристика на T2DM (Brunetti et al., 2014; Saisho, 2015). Поради своята многобройност и дългосрочни усложнения, като нефропатия, ретинопатия, невропатия и сърдечно-съдови нарушения и др., Спешно са необходими оптимални лечения и стратегии за превенция на T2DM (Rochester and Akiyode, 2014; Saisho, 2015; Tangvarasittichai, 2015).

Клинично има няколко налични класа на перорални агенти, включително сулфонилурейни продукти, меглитиниди, бигуаниди, инхибитори на α-глюкозидазата, инхибитори на дипептидил пептидаза-4, агонисти на допамин, секвестиращи жлъчни киселини, тиазолидиндиони и/или техните комбинации (Rochester и Akiyode, 2014; Marin-Penalver и др., 2016). За съжаление поради тяхната цена, неблагоприятни ефекти и т.н., и най-важното поради техния тесен спектър за насочване, става все по-необходимо да се разработват многоцелеви лекарства за лечение на заболявания чрез включване на множество фактори и пътища (Tian and Liu, 2012; 2014; Marin-Penalver et al., 2016). Билковите лекарства се използват широко, особено в развиващите се страни, за лечение на T2DM (Xiao и Högger, 2015; Loizzo et al., 2016; Vinayagam et al., 2017). Натрупването на експериментални данни и клинични проучвания потвърждават, че билките, като многокомпонентен комплекс, взаимодействащ с множество цели и функции, имат своите уникални предимства при лечението на сложни хронични заболявания, засягащи съвременните популации, като T2DM, но причиняват по-малка лекарствена резистентност (Tian and Liu, 2012; Rochester and Akiyode, 2014; Marin-Penalver et al., 2016).

Tang-Kang-Fu-San (TKFS), традиционно тибетско лекарство, разработено с билкова формула, строго следвайки принципите на „rGyud-bzhi“ (основен учебник по тибетска медицина), се използва широко за лечение на T2DM в продължение на много години в Китай, особено на платото Цинхай-Тибет. TKFS се състои от 11 лечебни билки, включително Berberis Kansuensis Schneid, Curcuma longa L, Phyllanthus emblica и др., за които се съобщава, че са клинично ефективни, но все още липсват научни доказателства за ефикасността и точните механизми за антидиабетната активност на TKFS. Следователно, за да се получат повече експериментални доказателства за по-добро клинично използване на TKFS, настоящото проучване анализира характеристиките на неговия химичен състав, изследва антидиабетните ефекти и възможните вътреклетъчни механизми на TKFS при db/db мишки, спонтанно T2DM животински модел (Wang et al., 2014).

Материали и методи

HPLC анализ на пръстови отпечатъци

Билковата формула на TKFS е предоставена от Тибетския автономен институт на традиционната тибетска болница. За всяка партида TKFS (0,5 g) се претеглят точно и се екстрахират с 50 ml 50% метанол в ултразвукова водна баня в продължение на 20 минути. Добавят се допълнителни 50% метанол за регулиране на обема и след това разтворителят се филтрира през 0.22 μm микрофилтрационна мембрана.

Многокомпонентните компоненти на TFKS бяха анализирани със системата Agilent 1260 HPLC (Карлсруе, Германия), включително система за подаване на четвъртичен разтворител, он-лайн дегазатор, автоматичен пробовземач, контролер за температура на колоната и детектор на фотодиодна решетка, заедно с аналитична работна станция. Пробите бяха анализирани с помощта на колона Waters SunFire C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) при 30 ° C. Бинарната градиентна елуираща система се състои от метанол (А) и 0,2% фосфорна киселина (В) и разделянето се постига, като се използва следната градиентна програма: 0–15 минути, 97% В; 15–16 мин, 97–85% В; 16–90 мин., 85–50% В. Скоростта на потока беше зададена на 1,0 ml/min и обемът на инжектиране на пробата беше 10 μL. Дължината на вълната на детектиране е настроена на 273 nm.

Анализът на данните е извършен от професионален софтуер, наречен Система за оценка на сходството за хроматографски пръстов отпечатък на традиционната китайска медицина, съставен от Комитета по китайска фармакопея (Версия 2009 A), препоръчан от Китайската администрация по храните и лекарствата (CFDA) (Tang et al., 2014; He et al., 2015).

Животни и наркотици

Седемседмична мъжка диабетна спонтанна диабетна мутация Lepr db мишки (наричани db/db мишки, н = 30, телесно тегло, 39,5 ± 1,6 g) и недиабетни дивечи от дивия тип (наричани WT мишки, н = 6, телесно тегло, 19,9 ± 0,8 g) са закупени от Модел за изследвания на животни на Университета в Нанкин (Нанкин, Китай). Те бяха настанени в помещения за животни с SPF при 12-часов цикъл светлина-тъмнина с подходяща относителна влажност (55 ± 5%) и температура (22 ± 2 ° C). Преди експеримента всички мишки бяха аклиматизирани за 1 седмица в околната среда. Всички експериментални процедури с животни следваха международните насоки за грижи и използване на лабораторни животни и бяха одобрени от Комитета по етика на животните към Южно-централния университет за националности. Таблетките метформин са закупени от фармацевтичната фабрика в Пекин Jing Feng (Пекин, Китай).

Експериментален процес

Db/db мишките бяха разделени на случаен принцип в пет групи (н = 6 на група): db/db мишки плюс 0,9% физиологичен разтвор (контролна група за модел), db/db мишки плюс ниска доза от група TKFS (TKFS 0,5 g/kg), средна доза от група TKFS (TKFS 1,0 g/kg ) и висока доза от TKFS група (TKFS 2,0 g/kg), db/db мишки плюс метформин група (Metformin 200 mg/kg) и WT мишки плюс 0,9% физиологичен разтвор (н = 6 като нормална контролна група). Според указанията на етикета, използвани при хора (6 g/ден на възрастен), преобразуването на дозата от човек в мишки се преобразува в зависимост от телесната повърхност и в крайна сметка дозите TKFS са определени по-горе за мишките.

Както TKFS, така и метформинът се разтварят в 0,9% физиологичен разтвор и мишките се третират чрез орално администриране с дози, описани по-горе веднъж дневно в продължение на 4 седмици. В края на последната седмица всички мишки бяха на гладно през нощта. След тестване на FBG, всички мишки бяха умъртвени с предозиране на интраперитонеална инжекция на пентобарбитал (90 mg/kg). Кръвта на мишката бързо се събира и незабавно се центрофугира (4 ° C, 300 g за 10 минути), за да се вземат проби от кръвен серум, които впоследствие се съхраняват при -20 ° C за допълнителен анализ. Тъканите на панкреаса се дисектират и веднага се потапят в 4% параформалдехид за хистологичен анализ. Скелетните мускули бяха дисектирани и незабавно замразени в течен азот или фиксирани в 4% параформалдехид за Western blot или имунохистохимичен анализ.

Глюкоза на гладно (FBG) и телесно тегло

Глюкозата в кръвта на гладно и телесното тегло се измерват от 08:00 до 08:30 на първия ден от всяка седмица по време на лечението след гладуване през нощта. Кръвните проби бяха получени чрез убождане с опашка и измерени чрез използване на стандартен глюкометър (LifeScan, Inc., Milpitas, CA, САЩ). Теглото на тялото е измерено с електронна везна за претегляне.

Интраперитонеален (i.p.) тест за инсулинова толерантност (IPITT) и i.p. Тест за толерантност към глюкоза (IPGTT)

В IPITT теста, след като мишките са гладували в продължение на 6 часа през втората седмица на експеримента, те са били i.p. инжектиран с инсулин при 0,75 IU/kg, както се съобщава по-рано (Liu et al., 2014; Zhang et al., 2014), а нивата на кръвната глюкоза се проследяват на 0, 30, 60 и 120 минути след инжектирането на инсулин. Общата площ под кривата (AUC) на глюкозата от периода на вземане на проби от 0 до 120 минути се определя като стойност на AUC (Runtuwene et al., 2016).

IPGTT се извършва на мишки на третата седмица от лечението с TKFS след гладуване през нощта, след което D-глюкоза (0.75 g/kg) се извършва от i.p. инжекция на всяка мишка (Zhang et al., 2014). Нивата на кръвната захар, както и стойностите на AUC бяха записани, както е описано по-горе.

Нива на серумен инсулин на гладно (FINS) и анализ на модела на хомеостазата за анализ на инсулиновата резистентност (HOMA-IR)

Нивото на серумния инсулин на гладно се измерва чрез използване на ензимно-свързан имуносорбентен тест за миши инсулинов комплект ELISA (CSB-E05071m, CUSABIO BIOTECH CO., Ltd, Wuhan, Китай). IR стойността беше изчислена съгласно предишно проучване (Dong et al., 2015), като се използва формула, както следва: HOMA-IR = FINS (μU/mL) × FBG (mmol/L) /22.5.

Биохимичен анализ

Общите нива на серумния общ холестерол (TC), триглицеридите (TG) и липопротеиновия холестерол с ниска плътност (LDL-C) бяха открити чрез използване на ензимни колориметрични комплекти и следване на инструкциите за продукта (Институт по биоинженерия в Нанкин Джианчен, Нанкин, Китай).

Хистологичен анализ на тъканите на панкреаса

Опашките на панкреаса от всяка мишка бяха фиксирани в 4% параформалдехид, последвано от обработка на влагане на парафин, секциониране на тъкани и оцветяване с хематоксилин и еозин (HE). Морфологичната структура на островчето на панкреаса е наблюдавана и фотографирана с помощта на оптичен микроскоп (BH-2, Olympus, Япония).

Имунохистохимичен анализ

Парафиновите секции бяха депарафинизирани в ксилол и рехидратирани чрез степенувани промивки с етанол, както е описано по-горе (Ma et al., 2015). След извличане на антиген с високотемпературно нагряване в цитратен буфер, предметните стъкла се инкубират с 3% H2O2 буфер в продължение на 10 минути и се измиват с PBST, след което се инкубират с анти-GLUT4 (ab33780, Abcam, Cambridge, United Kingdom) в 1: 100 разреждане при 4 ° C за една нощ. След измиване с PBST, предметните стъкла се инкубират с белязано с биотин вторично антитяло (PV-6001 Zhongshan Jinqiao Co., Ltd, Пекин, Китай) при стайна температура в продължение на 2 часа. След това срезовете бяха инкубирани с авидин-биотин-пероксидазен комплекс (1:50, Elite ABC Ki, Vector) при стайна температура в продължение на 2 часа. Накрая след измиване с PBST, срезовете бяха инкубирани с реакционен буфер, съдържащ 0,02% (w/v) DAB и 0,003% (v/v) H2O2 в 0,01 M Tris-HCl (pH 7,4) при стайна температура за 5-10 min . След оцветяване с DAB, предметните стъкла се измиват, дехидратират отново и се монтират, накрая се наблюдават и снимат под оптичен микроскоп (BH-2, Olympus, Япония).

Анализ на Western Blot

Общият протеин от скелетните мускули се извлича, както е описано по-рано (Yang et al., 2015). След това протеинът се фракционира върху 10% натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза (SDS-PAGE) и се прехвърля върху PVDF мембрана. След блокиране с 5% обезмаслено мляко за 1 h, мембраните се инкубират с анти-Akt (# 4685), анти-фосфо-AktSer473 (# 4060), анти-GLUT4 (# 2213), анти-AMPKα (# 5831 ), фосфо-AMPKα (Thr172) (# 2535) (CST, Danvers, MA, САЩ) и анти-GAPDH (Proteintech, Wuhan, Китай) първични антитела при разреждане 1: 1000 при 4 ° C за една нощ. След това мембраната се промива в TBST и се инкубира с подходящи конюгирани вторични антитела с хрян пероксидаза. Протеиновите ленти се визуализират с помощта на BeyoECL Plus (P0018, Beyotime Biotechnology, Китай) и се извършва анализ на денситометрия с помощта на софтуера ImageJ (NIH, Bethesda, MD, САЩ). GAPDH се използва като вътрешен контрол за полуколичествен анализ.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средни стойности ± SEM. За статистически анализ и графики на данните е използван софтуер GraphPad Prism 5 (Сан Диего, Калифорния, САЩ). Несдвоени т-тестът е използван за анализ на статистически сравнения между две групи. Множествените сравнения бяха сравнени чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от Bonferroni’s post hoc тестове. стр-стойност 0,05) (Фигура 2Б).

ФИГУРА 2. Ефекти на TKFS върху кръвната глюкоза на гладно (FBG) (А) и телесно тегло (Б). FBG и телесното тегло са измерени от 08:00 до 08:30 на първия ден от всяка седмица. ++ стр ∗ стр ∗∗ стр ++ стр ∗ стр ∗∗ стр ++ стр ∗∗ стр ++ стр ∗∗ стр ∗∗ стр ++ стр ∗ стр ∗∗ стр Ключови думи: традиционна тибетска медицина, диабет, Akt, AMPK, db/db мишки

Цитиране: Duan B, Zhao Z, Liao W, Xiong H, Liu S, Yin L, Gao T и Mei Z (2017) Антидиабетно въздействие на тибетската медицина Tang-Kang-Fu-San в db/db Мишки чрез активиране на PI3K/Akt и AMPK Pathways. Отпред. Pharmacol. 8: 535. doi: 10.3389/fphar.2017.00535

Получено: 21 март 2017 г .; Приет: 31 юли 2017 г .;
Публикувано: 24 август 2017 г.

Джианбо Сяо, Университет в Макао, Китай

Yonghui Zhang, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Китай
Rajendra Karki, Детска болница за детски изследвания в Сейнт Джуд, САЩ