Отделение за клетъчна и молекулярна физиология и Отдел по хранене, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

бактерии

Отделение за клетъчна и молекулярна физиология и Департамент по хранене, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

Отделение по гастроентерология, Университетски медицински център Вандербилт, Нашвил, Тенеси, Съединени американски щати

Отдел за биомедицински и биологични науки, Училище за здраве и медицина, Университет Ланкастър, Ланкастър, Великобритания

Отделение за клетъчна и молекулярна физиология и Отдел по хранене, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

Отделение за гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

Отделение за клетъчна и молекулярна физиология и Отдел по хранене, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

Отделение за клетъчна и молекулярна физиология и Отдел по хранене, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

  • Шенгли Динг,
  • Майкъл М. Чи,
  • Брукс П. Череп,
  • Рейчъл Ригби,
  • Никол М. J. Schwerbrock,
  • Скот Магнес,
  • Кристиан Джобин,
  • Полин К. Лунд

Фигури

Резюме

Заден план

Затлъстяването, индуцирано от диета с високо съдържание на мазнини (HF), е свързано с възпаление, което допринася за развитието на инсулинова резистентност. Повечето предишни проучвания са фокусирани върху мастната тъкан като източник на свързано със затлъстяването възпаление. Все повече доказателства свързват чревните бактерии с развитието на диета, индуцирано затлъстяване (DIO). Това проучване тества хипотезата, че HF западната диета и чревните бактерии взаимодействат, за да насърчат чревното възпаление, което допринася за прогресирането на затлъстяването и инсулиновата резистентност.

Методология/Основни констатации

Обикновено отглежданите мишки без специфичен патоген (CONV) и без микроби (GF) получават HF или диета с ниско съдържание на мазнини (LF) за 2-16 седмици. Измерва се телесното тегло и затлъстяването. Чревното възпаление се оценява чрез оценка на TNF-α иРНК и активиране на NF-kB EGFP репортерен ген. При CONV, но не при GF мишки, индуцираната от HF диета увеличава телесното тегло и затлъстяването. HF диета индуцира илеална TNF-α иРНК при CONV, но не и GF мишки и това увеличение предшества затлъстяването и силно и значително корелира с индуцирано от диетата наддаване на тегло, затлъстяване, плазмен инсулин и глюкоза. При CONV мишки HF диетата също води до активиране на NF-κB EGFP в епителни клетки, имунни клетки и ендотелни клетки на тънките черва. Допълнителни експерименти демонстрираха, че фекалните суспензии от CONV мишки, хранени с HF диета, са достатъчни, за да активират NF-κB EGFP в GF NF-κB EGFP мишки.

Заключения/Значение

Бактериите и СН диетата си взаимодействат, за да насърчат провъзпалителни промени в тънките черва, които предшестват наддаване на тегло и затлъстяване и показват силни и значими връзки с прогресията на затлъстяването и развитието на инсулинова резистентност. Доколкото ни е известно, това е първото доказателство, че чревното възпаление е ранна последица от високочестотната диета, която може да допринесе за затлъстяването и свързаната с него инсулинова резистентност. Интервенции, които ограничават чревното възпаление, индуцирано от СН диета и бактерии, могат да предпазят от затлъстяване и инсулинова резистентност.

Цитат: Ding S, Chi MM, Scull BP, Rigby R, Schwerbrock NMJ, Magness S, et al. (2010) Диета с високо съдържание на мазнини: Взаимодействията с бактерии насърчават чревно възпаление, което предхожда и корелира със затлъстяването и инсулиновата резистентност при мишки. PLoS ONE 5 (8): e12191. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012191

Редактор: Силвана Гаетани, Университет Сапиенца в Рим, Италия

Получено: 15 април 2010 г .; Прието: 1 юли 2010 г .; Публикувано: 16 август 2010 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена с постдокторантска стипендия на M. Chi (T32 MH075854-05) и пилотен грант от Националния институт по екологични здравни науки (P30ES10126). IDOC: http://www.cpc.unc.edu/idoc. NIEHS: http://cehs.sph.unc.edu/index.html. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Методи

Декларация за етика

Всички проучвания са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните (IACUC) към Университета на Северна Каролина в Чапъл Хил (номер на одобрения протокол: 07-229).

Животни

Четири седмични CONV, но без специфични патогени (SPF) мишки C57BL/6 бяха закупени от Jackson Laboratories (Jackson labs, Bar Harbor, ME) и бяха подложени на диетична интервенция в нашето SPF животно съоръжение. GF C57BL/6 мишки бяха отглеждани в UNC-CH гнотобиотично съоръжение и поддържани в GF условия по време на диетичните интервенции. NF-κB EGFP нокаинови мишки (C57BL/6) са описани по-рано [16]. Накратко, този модел съдържа едно копие на трансген, съдържащ елементи на NF-κB-отговор, задвижващи EGFP, ударен в геномния локус на хипоксантин фосфорибозилтрансферазата. Тези мишки се поддържат, тъй като са идентифицирани хемизиготи и трансгеници чрез изследване на опашки за експресия на EGFP. За предложени проучвания са използвани мъжки CONV и GF NF-κB EGFP мишки.

Диетична интервенция

Мишките CONV, мишките CONV NF-κB EGFP и мишките GF бяха избрани на случаен принцип, за да получат или HF диета (45% kcal от мазнини, D01060502, Research Diets, New Brunswick, NJ) или LF диета (10% kcal от мазнини, D01060501, Research Diets, New Brunswick, NJ) за 2, 6 или 16 седмици (n = 4-8 на група). За експерименти с GF мишки диетите подлежат на облъчване (50 kGy) (Neutron Products, MD). Пилотни проучвания установяват, че CONV мишките, на които е дадена облъчена диета, са набрали подобно тегло, както при нестерилна диета.

Тегло и състав на тялото

Теглото на тялото се измерва на интервал от две седмици. Процентът телесни мазнини се определя чрез извършване на сканиране с двойна енергийна рентгенова абсорбциометрия (DEXA) (PIXImus Mouse Densitometer, GE, Piscataway, NJ) на 2, 6 или 16 седмици след началото на HF или LF диетите. DEXA сканиранията са получени под анестезия на изофлуран за оценка на мастната маса, процента мазнини и чистата телесна маса.

Събиране на проби

Животните бяха евтаназирани с предозиране на натриев пентобарбитал, прилаган интраперитонеално. Сърдечната пункция се използва за получаване на кръв, която се поставя върху лед и се центрофугира за събиране на плазма. Илеумът и дебелото черво бяха разрязани и внимателно отстранени от всички прилепнали мезентерии или мазнини. Съответните сегменти тъкан от всяко животно бяха фиксирани в 10% формалин или 4% параформалдехид (PFA) за хистология или замразени за екстракция на РНК.

Измерване на глюкоза и инсулин на гладно на гладно

Плазмената глюкоза на гладно се измерва със стандартен биохимичен метод (# 439-90901, Wako Diagnostics, Richmond, VA) и инсулин на гладно чрез ELISA (# EZRMI-13K, комплект за инсулин ELISA от плъх/мишка, Millipore, Billerica, MA). Стойностите на оценката на хомеостатичния модел (HOMA) бяха изчислени като оценка на инсулиновата чувствителност, като се използва формулата плазмена глюкоза на гладно (mmol/L) × инсулин (µU/ml)/22,5. По-високите стойности на HOMA показват намалена инсулинова чувствителност.

Екстракция на РНК и PCR в реално време

Общата РНК се изолира от илеума и дебелото черво, използвайки метода TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA се генерира, като се използва AMV обратна транскриптаза и праймер Oligo (dT) 15 в присъствието на инхибитор на RNasin рибонуклеаза. Всички реактиви за обратна транскрипция са получени от Promega (Madison, WI). QPCR в реално време беше извършен върху Светлинния цикъл (Rotor-Gene 3000, Corbett Life Science, Сан Франциско, Калифорния). Праймери и флуоресцентни репортерни сонди са получени от Operon (Huntsville, AL). Последователностите бяха както следва: TNF-α F: 5′-CTGTCTACTGAACTTCGGGGTGAT-3 ′, R: 5′-CATCAGTTCTATGGCCCAGACC-3 ′ и маркирана с FAM сонда: 5′-FAM-ATGAGAAGTTCCCAAATGGCCTCCCTC-TAMRA-. Резултатите бяха нормализирани към домакински ген HMBS F: 5′-TGTGTTGCACGATCCTGAAAC-3 ′, R: 5′-CTCCTTCCAGGTGCCTCAGAA-3 ′ и 5′-FAM-TTCGCTGCATTGCTGAAAGGG-TAMRA-3 ′ сонда. Стойностите на прага на цикъла (Ct) за TNF-α и HMBS бяха преобразувани в количествени стойности въз основа на стандартните криви. Всички индивидуални стойности се изразяват като кратна промяна в сравнение с LF диетата във времето от 2 седмици.

Подобрено GFP (EGFP) изображение

NF-κB EGFP мишки, на които се дава HF или LF диета, се упояват и евтаназират. Червата бяха дисектирани и промити с ледено студено 1 × PBS и незабавно заснети с помощта на свързана със заряд камера в светлонепроницаема кутия за изображения с двоен филтриран източник на светлина и емисионни филтри, специфични за EGFP (LT-99D2 Illumatools; Lightools Research), Encinitas, Калифорния). Черва от животни, хранени с HF/LF, също са заснети с помощта на стерео дисекционен микроскоп Leica 16FA. За улавяне на изображения в рамките на всеки експеримент бяха използвани еднакви времена на експозиция.

Клетъчни места на експресия на NF-κB EGFP

GFP се визуализира директно под конфокален микроскоп върху замразена секция, монтирана в гел-монтиране. Имунофлуоресценция се извършва на замразени срезове, изрязани от илеум и дебело черво, фиксирани в 4% PFA, криозащитени в степенувана захароза и вградени в O.C.T. (Tissue-Tek, Torrance, CA). Преди първичната инкубация на антитела, замразените секции бяха предварително обработени с 0,05 М разтвор за извличане на епитоп Tris Triton (TT) при стайна температура (RT) за 30 минути и блокирани в 5% нормален кози серум (NGS), разреден в TT буфер за 1 час. Използваните първични антитела са изброени в таблица 1. Първичните антитела се разреждат в 5% NGS/TT буфер. Срезите бяха инкубирани с първични антитела за една нощ при 4 ° С в камера за влажност. След промиване 3 пъти в 0,05 М Tris буфер, срезовете бяха инкубирани с вторични антитела (виж Таблица 2) в продължение на 1 час при RT. Оцветяването с нуклеинова киселина се извършва чрез маркиране с бисбензамид в продължение на 10 минути. След три измивания с 0,05 М Tris, покривни стъкла бяха монтирани в гел-монтиране (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Снимките са направени от Leica SP2 вертикален лазерен сканиращ конфокален микроскоп (Leica) и са анализирани с Leica SP2 вертикално лазерно сканиращо конфокално изображение (Leica).

Конвенционализиране на GF NF-κB EGFP с фекални суспензии от мишки, получаващи HF или LF диета

Пресни изпражнения са получени от CONV мишки, хранени с HF или LF диета за> 16 седмици. Фекални суспензии се получават чрез суспендиране на 1,2 g HF/LF изпражнения в 4 ml стерилен 1 × PBS (физиологичен разтвор, буфериран с фосфат). Мустаците и ректума на всяка мишка се натриват с памучен тампон, напоен с кална суспензия. След това колонизирани GF мишки бяха хранени със стерилизирана редовна чау диета и стерилна вода в продължение на 2 седмици преди евтаназия.

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± стандартна грешка. Данните при CONV или GF мишки бяха сравнени за ефект на диета чрез еднопосочен ANOVA и post-hoc тестове, използвани за двойни сравнения (тест на Tukey). Линейната регресия, използваща коефициентите на корелация на Pearson, беше използвана за тестване на корелациите между ileal TNF-α и телесно тегло, маслена маса,% мазнини, плазмени нива на глюкоза и инсулин. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуер STATISTICA версия 9 (Statsoft вкл. Tulsa, ОК). Стойността на P по-малка от 0,05 се счита за статистически значима.

Резултати

HF диетата увеличава телесното тегло и процента на телесните мазнини при CONV мишки

CONV мишките с HF и LF диети имат сходни телесни тегла в началото на експеримента (Фигура 1). Към 12-та седмица и за останалата част от експеримента CONV мишки, хранени с HF диета, показват статистически значимо нарастване на телесното тегло (P 0,05 във всички времеви точки), а GF мишките, хранени с HF или LF диета, показват телесни тегла през 16-седмичния период, които не се различават от CONV мишки на LF диета (Фигура 1А и В). CONV мишките, получили HF и LF диета, са имали сходен процент телесни мазнини и мастна маса на 2 седмици след началото на диетичната интервенция. Към 6 седмица CONV мишките с HF диета са имали значително повишен процент телесни мазнини и мастна маса в сравнение с животните на LF диета и това увеличение е по-драматично до 16 седмици (P Фигура 1. Телесно тегло и мастна маса при CONV или GF мишки ВЧ/НЧ диета.

Хистограмите показват средна стойност ± SE. a: P Фигура 2. Нива на TNF-α иРНК в червата на CONV или GF мишки на HF/LF диета.

Хистограмите показват средна стойност ± SE, изразена като кратна промяна спрямо средното ниво на иРНК при мишки, хранени с LF диета за 2 седмици. a: P Таблица 3. Коефициенти на корелация между ileal TNF-α и телесно тегло, затлъстяване при всички CONV и GF мишки на HF и LF диета в различен момент от време.

Ileal TNF-α иРНК и инсулинова резистентност

Тъй като TNF-α е свързан със свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност, ние оценихме плазмената глюкоза, инсулин и HOMA при CONV мишки, хранени с HF или LF диета и тествахме за корелации с ileal TNF-α. Както е наблюдавано по-рано при мишки CONV C57BL/6, високочестотната диета е свързана с драстично повишаване на плазмения инсулин и HOMA, но само след 16-седмична диета (Фигура ЗА и ЗС). Освен малко и преходно увеличение на плазмената глюкоза при мишки, хранени с високочестотна диета в продължение на 2 седмици, плазмената глюкоза не се различава значително при мишките CONV, хранени с високочестотна или нискочестотна диета (Фигура 3В), което показва, че повишеният инсулин на 16 седмици е достатъчен за поддържане нормална плазмена глюкоза. Важно е, че при CONV мишки ileal TNF-α показва силна и силно значима корелация с плазмения инсулин и плазмената глюкоза (R стойности: инсулин = 0,89, P Фигура 3. Метаболитни измервания при CONV мишки, хранени с HF или LF диета.

Данните са изразени като средно ± SE; Обърнете внимание, че храната е била изтеглена от мишките 4 часа преди плазменото събиране за анализи на инсулин и глюкоза. a: P Таблица 5. Коефициенти на корелация между ileal TNF-α mRNA и плазмените нива на глюкоза и инсулин при CONV мишки, хранени с HF и LF диети.

HF диета, предизвикана от чревен NF-κB EGFP

Бяла стрелка: автофлуоресценция, която е често срещана в проксималното дебело черво. О: 2 седмици на СН/НЧ диета. B: 6 седмици на СН/НЧ диета. C:> 16 седмици на СН/НЧ диета. Съкращения: Duo: дванадесетопръстник; Jej: Jejunum; Ile: илеум; Col: дебело черво.

A, B и C показват репрезентативни изображения от 2 различни мишки, на които се дава високочестотна диета, за да илюстрират големи огнища (пейерни петна/лимфоидни агрегати) и по-малки огнища (в червата) на експресия на NF-κB EGFP (бели стрелки); D показва минимално активиране на NF-κB EGFP при мишки, хранени с LF диета. A: големи огнища в йеюнума (> 7.11 × увеличение). Б: големи и малки огнища в илеума (увеличение 7.11 ×). C: големи и малки огнища в илеума (увеличение 7.11 ×). D: големи и малки огнища в дисталния илеум (> 7.11 × увеличение).

A: NF-κB EGFP активиране в клетки в кръвоносния съд (10 ×). B: NF-κB EGFP активиране в епителни клетки върху лимфоиден агрегат (20 ×). C: NF-κB EGFP активиране в епителни клетки върху лимфоиден агрегат (10 ×). D: NF-κB EGFP активиране в епителни клетки над лимфоиден агрегат и субепителни клетки (20 ×).

(А) макрофаги; (В) В клетки; (С) неутрофили.

Фекални суспензии от мишки, хранени с HF диета, са достатъчни, за да активират NF-κB EGFP в GF NF-κB EGFP мишки

Ние колонизирахме GF NF-κB EGFP мишки с фекални суспензии от CONV мишки, хранени с HF или LF диета, след което хранехме и двете групи със стандартна чау и изследвахме активирането на NF-κB EGFP две седмици по-късно. Образното изследване показва засилено активиране на NF-κB EGFP при мишки, колонизирани с HF фекална суспензия в сравнение с тези, колонизирани от LF фекална суспензия (Фигура 9).

Фекална суспензия от мишки, хранени с HF диета, индуцира експресия на NF-κB EGFP в по-голяма степен, отколкото фекални суспензии от мишки, хранени с LF диета (Изображение, представително за наблюдение при 3 двойки мишки) в тъканите на червата на GF NF-κB EGFP мишки. Съкращения: Duo: дванадесетопръстник; Jej: Jejunum; Ile: илеум; Col: дебело черво.

Клетъчни места на активиране на NF-κB EGFP при CONV мишки, хранени с HF диета

Дискусия

Взаимодействието на диетите с бактерии и СН води до чревни възпаления и затлъстяване

Нашата констатация, че GF мишките са устойчиви на DIO, наддаване на тегло и затлъстяване, е в съответствие с последните открития на Backhed [12], [13]. Въпреки това, за разлика от Backhed, ние не наблюдаваме повишено телесно тегло,% мазнини или мастна маса при CONV мишки, съответстващи на възрастта, спрямо GF мишки в началото. При GF мишки, HF диетата доведе до малко увеличение на мастната маса с 16 седмици, но това беше много по-малко драматично, отколкото при мишките CONV, които също показаха по-ранно индуцирано от HF диета увеличение на мастната маса от GF мишките. Тези данни подчертават, че взаимодействието между бактериите и СН диетата води до по-ранни и по-големи промени в телесното тегло и затлъстяване, отколкото всеки от факторите поотделно.

Индуцираното от диетата възпаление при CONV мишки предхожда напълняването и затлъстяването

При CONV мишки, хранени с HF диета, увеличаването на TNF-α mRNA и NF-κB активирането на EGFP предшества HF диета, индуцирано увеличаване на теглото и предшества или възниква съвпадение с най-ранните откриваеми увеличения на мастната маса. По този начин нивата на чревна TNF-α иРНК, използвайки високочувствителна PCR в реално време или NF-κB EGFP репортер, представляват полезен биомаркер за ранните провъзпалителни ефекти на HF диетата върху червата. Интересно е, че свързаното с високочестотната диета повишаване на TNF-a се е случило в илеума, а не в дебелото черво, което предполага, че бъдеща оценка на ефектите от високочестотната диета конкретно върху микробиотата на тънките черва ще бъде от интерес. Индукцията на тези проинфламаторни биомаркери преди началото на значително увеличаване на теглото (на 8 седмици) и измеримо повишаване на затлъстяването (6 седмици), за разлика от мастното възпаление, което обикновено се случва след появата на DIO. Това подкрепя концепцията, че ранните провъзпалителни ефекти от ВЧ диетата - взаимодействията на бактериите в червата могат да послужат като стимул за последващо възпаление в други органи или системно възпаление.

Индукцията на TNF-α в тънките черва предхожда и корелира с развитието на инсулинова резистентност и затлъстяване